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《南京农业大学》 2009年
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兽疫链球菌荚膜多糖的制备、鉴定及生物活性的研究

柯春林  
【摘要】: 兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)即马链球菌兽疫亚种(Streptoco-ccus equi subsp. zooepidemicus)的旧称。兽疫链球菌菌体表面有一层肥厚的荚膜,其主要成分为透明质酸(Hyaluronic acid, HA).据报道,HA具有抗氧化、免疫调节,抗炎症和促进伤口愈合,促血管生成和抗肿瘤等生物活性。由于国内外对兽疫链球菌荚膜多糖的研究侧重于其主要成分HA的研究,但关于HA抗氧化活性和免疫调节活性的报道较少,到目前为止,没有关于其次要成分化学结构及生物活性的报道,为了系统研究荚膜多糖的化学结构和生物活性,本论文对兽疫链球菌荚膜多糖各组分进行了分离纯化、结构鉴定及生物活性研究。 本论文共分五个部分,分别对兽疫链球菌产荚膜多糖的发酵条件、荚膜多糖的分离纯化和结构分析、抗氧化活性、免疫调节活性以及低分子量透明质酸抗氧化和免疫调节活性进行了研究。主要结果如下: 1.兽疫链球菌产荚膜多糖发酵条件的研究 通过单因素实验初步确定兽疫链球菌C55129菌株发酵生产HA的发酵条件。发酵培养基基本组成的碳源为葡萄糖,有机氮源为蛋白胨和酵母膏(以2:1比例配制)的复合氮源,无机氮源为NaNO3。无机盐为MgSO4·7H2O和K2HPO4、NaH2PO4·2H2O。合适的培养条件是装液量为10%,培养时间为18 h,温度为33℃,pH值为6.5,摇床转速为200rpm。其中,影响兽疫链球菌C55129菌株发酵生产HA的关键因素为时间、温度、葡萄糖浓度。 利用Design Expert实验设计软件,在原有单因素实验基础上,通过响应曲面法分别建立了兽疫链球菌C55129菌株发酵生产HA与主要发酵条件(时间、温度和葡萄糖浓度)的二次多项数学模型,并利用统计学方法对该模型进行了显著性检验和有效性验证。借助模型方程的响应面图及其等高线图,对关键影响因素间的交互作用进行了深入的研究与探讨,分析得出了各关键要素的合适浓度水平范围。优化前HA最高产量为1.015 g/L,优化后为1.473 g/L, HA产量提高到1.45倍,实验值与预测值相符。 2.兽疫链球菌荚膜多糖的分离纯化和结构分析 从兽疫链球菌C55129菌株发酵液中提取到荚膜多糖粗品(CCP),该CCP经过离子交换色谱得到部分纯化的荚膜多糖(PCP),发现CCP和PCP的主要成分是HA。通过DEAE-52纤维素阴离子交换柱层析和Sephadex G-100凝胶柱层析从CCP中分离到三个多糖组分,命名为PCP-Ⅰ、PCP-Ⅱ和PCP-Ⅲ,得率分别为5.989%、5.079%和48.932%。PCP-Ⅰ、PCP-Ⅱ和PCP-Ⅲ均为白色固体,都易溶于水,分子量分别为0.0292x103kDa、0.891×103kDa和1.338 x103kDa。 利用气相色谱法分析荚膜多糖的单糖组成,PCP-Ⅰ单糖组成及摩尔比为阿拉伯糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=0.99:27.03:11.84:1.00。PCP-Ⅱ单糖组成及摩尔比为甘露糖:葡萄糖:半乳糖=6.87:4.65:1.00。通过高效液相色谱法分析,PCP-Ⅲ由GlcA和GlcNAc组成,其百分含量依次为43.75%和40.31%。 由红外光谱、GC、GC-MS、高碘酸氧化、Smith降解和NMR分析可知PCP-Ⅰ是以1,6连接的α-型吡喃甘露糖、葡萄糖为主链并含有少量半乳糖、阿拉伯糖的中性多糖。PCP-Ⅱ是以1,2连接的α-型吡喃甘露糖、葡萄糖为主链并含有糖醛酸和少量半乳糖的酸性多糖。PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ为首次从兽疫链球菌C55129菌中分离到的两种结构新颖的多糖。PCP-Ⅲ存在着羧基和乙酰胺基结构,具有β-型吡喃糖苷键构型,具有HA的典型结构。 3.兽疫链球菌荚膜多糖抗氧化活性的研究 通过不同的体外抗氧化实验和建立在以D-半乳糖所致的动物亚急性衰老模型基础上的体内抗氧化实验,系统研究了兽疫链球菌C55129菌株荚膜多糖的抗氧化活性。体外抗氧化实验结果表明CCP、PCP-Ⅰ、PCP-Ⅱ和PCP-Ⅲ都有较强的抑制脂质过氧化作用。在同样的浓度条件下,CCP、PCP-Ⅰ、PCP-Ⅱ和PCP-Ⅲ有较好的清除DPPH自由基、O2·-和·OH活性的能力,PCP-Ⅲ的能力最强,CCP的较强,PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ的适中。PCP-Ⅰ和CCP有较强的还原力和螯合金属离子的能力,PCP-Ⅰ的还原力和螯合金属离子强于CCP的,PCP-Ⅱ和PCP-Ⅲ的较弱。由此可见,荚膜多糖具有较强的体外抗氧化活性,它的三个组分PCP-Ⅰ、PCP-Ⅱ和PCP-Ⅲ具有不同层次的抗氧化能力。 在体内抗氧化实验中,通过连续15天给D-半乳糖亚急性衰老小鼠口服CCP和PCP,发现CCP和PCP能提高亚急性衰老小鼠体内的抗氧化酶活性和总抗氧化能力水平,减少老龄化产生的自由基引起的脂质过氧化,而且多糖的剂量不同起抗氧化能力不同,总的来说,在小鼠体内,PCP的抗氧化能力高于CCP的。本研究表明从兽疫链球菌C55129菌株发酵液中提取到的荚膜多糖具有直接的或潜在的抗氧化活性。 4.兽疫链球菌荚膜多糖免疫调节活性的研究 通过建立在以环磷酰胺(CY)所致的免疫抑制小鼠模型基础上的体内免疫试验,测定了荚膜多糖PCP对2,4-二硝基氟苯(DNFB)诱导的小鼠迟发型超敏反应、小鼠血清溶菌酶含量及小鼠脾脏指数及胸腺指数的影响,结果表明PCP有较好的免疫调节能力,能提高免疫抑制小鼠的免疫能力。 体外的免疫试验中,通过测定荚膜多糖对小鼠巨噬细胞和脾脏淋巴细胞功能的影响,结果表明荚膜多糖能增强小鼠巨噬细胞吞噬异物的能力,促进脾脏淋巴细胞的转化。荚膜多糖组分PCP-Ⅱ和PCP-Ⅲ都有较强的增强小鼠巨噬细胞吞噬异物和促进脾脏淋巴细胞转化的能力,明显高于PCP-Ⅰ和CCP。这说明荚膜多糖能提高机体的非特异性免疫和特异性免疫功能力,而且PCP-Ⅱ和PCP-Ⅲ的免疫调节作用较显著。由此可见,荚膜多糖具有较好的免疫调节能力,它的三个组分PCP-Ⅰ、PCP-Ⅱ和PCP-Ⅲ都具有一定程度上的非特异性免疫和特异性免疫调节功能。 5.低分子量透明质酸抗氧化和免疫调节活性的研究 制备到分子量为1.302×105Da的低分子量透明质酸(LMWHA)。通过建立在以CY所致的免疫抑制小鼠模型基础上的体内抗氧化实验和不同的体外抗氧化实验,系统研究了LMWHA的抗氧化活性。在体内抗氧化实验中,通过连续7天给免疫抑制小鼠口服LMWHA,发现LMWHA能提高免疫抑制小鼠体内的抗氧化酶活性、总抗氧化能力水平和免疫能力,而且LMWHA的剂量不同其抗氧化能力不同。在体外抗氧化实验中,比较了LMWHA与荚膜多糖组分PCP-Ⅲ的抗氧化活性,发现LMWHA有较强的抑制脂质过氧化和清除羟自由基的能力,适度的清除DPPH自由基和O2·-的能力,较弱的的还原力和螯合金属离子的能力,LMWHA的体外抗氧化能力高于PCP-Ⅲ。由此可见,LMWHA具有直接的或潜在的抗氧化活性,能保护免疫抑制小鼠体组织和器官的氧化损害。 在免疫抑制小鼠体内的免疫试验中,通过测定LMWHA对DNFB诱导的小鼠迟发型超敏反应、小鼠血清溶菌酶含量及小鼠脾脏指数及胸腺指数的影响,表明LMWHA具有较强的免疫刺激作用。体外的免疫试验中,比较了LMWHA与荚膜多糖组分PCP-Ⅲ。的免疫调节活性,通过测定LMWHA对小鼠巨噬细胞和脾脏淋巴细胞功能的影响,结果表明LMWHA能增强小鼠巨噬细胞吞噬异物的能力,促进脾脏淋巴细胞的转化。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S852.6

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【参考文献】
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7 杨育芳;B群链球菌多糖-蛋白质结合疫苗的研究和制备[D];西北大学;2004年
8 祝庆;兽疫链球菌NW—162型菌株透明质酸发酵及提取工艺研究[D];西北大学;2001年
9 郭宇;奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌荚膜多糖主要血清型的鉴定及cap8J基因的克隆表达[D];内蒙古农业大学;2011年
10 罗强;兽疫链球菌生产透明质酸的研究[D];四川大学;2003年
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