收藏本站
《南京农业大学》 2009年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

肠上皮细胞紧密连接调节的研究

庾庆华  
【摘要】: 肠黏膜屏障可有效地阻挡肠道内微生物及其毒素向肠腔外组织扩散,是机体重要的保护屏障。细胞连接是肠黏膜屏障的重要组成部分,是物质通过细胞旁路转运的限制因素,影响蛋白质等大分子亲水性药物和疫苗的吸收效率。最近研究发现一些病原菌粘附定植后,可分泌毒素特异性地作用于肠黏膜屏障,包括肠上皮细胞的损伤和细胞连接蛋白以及细胞骨架蛋白的破坏。本研究主要分为两大部分:一是通过Caco-2细胞(human colon carcinoma cell)单层模型和小鼠实验,研究吸收促进剂对细胞连接(紧密连接和粘附连接)和细胞旁路的调节,观察吸收促进剂对荧光标记分子和胶原酶的促吸收作用;二是利用Caco-2细胞单层模型和大鼠灌胃实验,观察乳酸杆菌对细胞连接蛋白表达和分布的影响,研究乳酸杆菌对病原菌的粘附抑制能力,揭示乳酸杆菌拮抗病原菌粘附的机理。主要分为以下四个试验: 试验一:吸收促进剂对Caco-2细胞连接的影响 Caco-2细胞体外培养可分化为肠上皮细胞,结构和生化作用与人肠上皮细胞十分相似,具有微绒毛和紧密连接等,是研究肠上皮细胞功能的理想模型,如药物吸收、肠道屏障、细胞分化等。本试验筛选六种吸收促进剂:EDTA、SDS、胆酸钠、葡萄糖、乙醇和薄荷醇,研究在不同的作用时间和作用浓度下吸收促进剂对Caco-2细胞活性、细胞连接蛋白的表达和分布以及细胞旁路的影响。MTT细胞毒性试验结果显示:与对照组相比,EDTA (2.5mmol/L)、SDS(0.2mmol/L)、胆酸钠(10mmol/L)、葡萄糖(750mmol/L)、乙醇(10%)和薄荷醇(1%)在2h内不影响Caco-2细胞活性。转运试验结果表明六种吸收促进剂对不同分子量大小的细胞旁路荧光标记分子FITC (MW 389.4)、FD70S (MW 70,000)和FD2000S (MW 2,000,000)均具有极显著的促吸收作用(P0.01)。与对照组相比,在2h内EDTA (2.5mmol/L)极显著地促进了FITC的转运量(P<0.01); SDS (0.2mmol/L)和薄荷醇(1%)极显著促进了FD20S的吸收(P0.01);而葡萄糖(750mmol/L)和薄荷醇(1%)则极显著提高了FD2000S转运量(P0.01)。同时我们发现,空白对照组中ZO-1、claudin-1、occludin和E-cadherin四种细胞连接蛋白均沿细胞膜分布,界限清晰,勾勒出正常细胞的形态。吸收促进剂作用后,ZO-1、claudin-1、occludin和E-cadherin蛋白表达下降,部分蛋白散在分布于细胞质中,荧光强度减弱,提示紧密连接和粘附连接结构遭到不同程度的破坏。本试验证明葡萄糖(750mmol/L)和薄荷醇(1%)在2h内不影响Caco-2细胞活性,对细胞连接蛋白影响较小,同时极显著地促进大分子标记物FD2000S的吸收,具有良好的应用前景。 试验二吸收促进剂对胶原酶在吸收效果的影响 胶原酶可直接溶解纤维蛋白和间接激活纤溶酶原、改善微循环,是目前较为理想的临床溶栓药物。本研究在试验一的基础上,结合Caco-2细胞单层模型(体外)和小鼠灌胃(体内)试验,观察吸收促进剂对异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记的胶原酶在肠上皮的促吸收效果。Caco-2细胞转运试验结果显示:与对照组相比,六种吸收促进剂均可显著增加胶原酶的转运效率(P0.05),但促吸收效果依吸收促进剂的不同而有所差别。在2h时,促吸收效果强弱依次为葡萄糖(12.87±1.0%) EDTA (12.71±0.74%)胆酸钠(11.27±1.21%)薄荷醇(11.71±0.73%)>SDS(9.17±1.74%)>乙醇(8.37±0.74%)>空白对照组(6.60±1.70%)。小鼠灌胃试验进一步证明吸收促进剂可显著促进胶原酶的转运效率(P0.05),在2h时,促吸收强弱顺序为:葡萄糖(29.25±3.43%)EDTA (26.25±2.60%)胆酸钠(22.50±2.60%)薄荷醇(17.24±1.33%)SDS(14.25±1.50%)乙醇(11.25±1.30%)空白对照组(10.5±1.98%)。同时苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE)结果显示肠黏膜形态正常,绒毛完整,无炎症。本试验证明吸收促进剂不仅能增加胶原酶在肠上皮的转运量,改善胶原酶口服给药生物利用度低的难题;同时并不损伤肠黏膜,安全性较好。 试验三乳酸杆菌对肠上皮细胞连接的影响 细胞连接能有效的阻止肠腔内细菌、毒素及炎症介质等物质的细胞旁路转运,维持肠黏膜屏障功能的完整。一些病原微生物可分泌毒素特异性地作用于细胞连接结构蛋白以及细胞骨架蛋白,破坏肠黏膜屏障。乳酸杆菌可以改善病原菌诱导的细胞连接结构紊乱的现象,但具体的作用机制尚不清楚。本研究结合Caco-2细胞单层模型(体外)和大鼠(体内)试验,观察产肠毒素大肠杆菌K88、沙门氏菌SARB21和SL1344对细胞连接蛋白claudin-1、occludin、ZO-1和E-cadherin的影响,同时探究乳酸杆菌对于病原菌诱导细胞连接蛋白的破坏是否具有保护作用。试验结果表明大肠杆菌K88、沙门氏菌SL1344和SARB21感染后,occludin、claudin-1、ZO-1和E-cadherin蛋白分布较正常组分散,强度减弱,细胞间隙增大,细胞轮廓不清晰。通过Western blot试验我们进一步证明,大肠杆菌K88、沙门氏菌SL1344和SARB21可使occludin、claudin-1、ZO-1和E-cadherin蛋白的表达均显著下降(P0.05),而乳酸杆菌则可改善病原菌侵袭后细胞连接蛋白分布紊乱的现象,但对细胞连接的改善程度具有菌株特异性。本试验证明大肠杆菌K88、沙门氏菌SL1344和SARB21可影响细胞连接蛋白(occludin、claudin-1、ZO-1和E-cadherin)的表达和分布,破坏细胞连接;而乳酸杆菌可改善病原菌的这种破坏作用,对于维持细胞连接结构和肠黏膜屏障功能起着重要作用。 试验四:乳酸杆菌对肠道病原菌粘附性能的影响 乳酸杆菌是肠道正常优势菌群,与肠黏膜紧密结合构成肠道的生物屏障,阻止细菌、病毒和食物抗原的入侵。试验三研究结果表明,乳酸杆菌可改善病原菌诱导的细胞连接结构紊乱的现象,我们推测乳酸杆菌可能是通过抑制病原菌对肠上皮细胞的粘附,降低病原菌对细胞连接的破坏程度,维护肠黏膜屏障。本研究采用Caco-2细胞模型,通过竞争试验(competition assay).排斥试验(exclusion assay)和置换试验(displacement assay),研究乳酸杆菌(嗜淀粉乳杆菌D14、德氏乳杆菌乳亚种R4、表达绿色荧光蛋白的德氏乳杆菌乳亚种D17、德氏乳杆菌德氏亚种D11、果糖乳杆菌C2和短乳杆菌)对大肠杆菌K88、沙门氏菌SL1344和SARB21的粘附抑制作用。试验结果显示六株乳酸杆菌对大肠杆菌K88、沙门氏菌SARB21和SL1344均表现出良好的抑菌特性,病原菌粘附数量显著下降(P0.05)。与对照组相比,在竞争试验中,德氏乳杆菌乳亚种R4和果糖乳杆菌C2极显著地降低了大肠杆菌K88的粘附数量(P0.01);在置换试验中,德氏乳杆菌德氏亚种D11显示了对沙门氏菌SARB21的良好拮抗作用,差异极显著(P0.01);在排斥试验中,德氏乳杆菌乳亚种D17和果糖乳杆菌C2则对沙门氏菌SL1344体现了良好的粘附抑制能力(P0.01)。同时我们发现,乳酸杆菌在竞争试验和排斥试验中对病原菌的拮抗作用要优于置换试验。本试验证明乳酸杆菌可显著抑制大肠杆菌K88、沙门氏菌SARB21和SL1344对肠上皮细胞的粘附,同时提示乳酸杆菌很可能通过与病原菌竞争上皮细胞受体来抑制病原菌的粘附,为乳酸杆菌的合理运用提供理论基础。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S852.4

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 戴国亮,代连花,于泳,谢莹;异硫氰酸荧光素-溶菌酶的制备及晶体生长预研究[J];化学学报;2005年07期
2 阎雪莹,张学农,张强;重组水蛭素在大鼠胃肠道中的吸收[J];药学学报;2004年01期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李传应;葛霞;;卵巢上皮性肿瘤中claudin3、claudin4的表达及其意义[J];安徽医药;2012年03期
2 陈磊;葛霞;;claudin的研究进展[J];蚌埠医学院学报;2007年04期
3 纪小奇;张荣新;曹金林;朱金海;;claudin-3、4在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义[J];蚌埠医学院学报;2011年01期
4 刘晨;齐凡;陈颖怡;黄亦存;;片球菌素在食品防腐保鲜中的应用研究进展[J];保鲜与加工;2012年04期
5 张新峰;裘福荣;蒋健;高成璐;;左金丸类方的小檗碱、巴马汀、黄连碱和药根碱在Caco-2细胞转运的比较研究[J];中华中医药杂志;2011年05期
6 杨天智,陈大兵,张强;不同吸收促进剂及酶抑制剂对胰岛素体内及体外口腔黏膜渗透性的影响[J];北京大学学报(医学版);2001年03期
7 陈祎招,立花修,长谷川光广,徐如祥,山下纯宏;Claudin-5(CLN5)在小脑成血管母细胞瘤中的表达和意义[J];中华神经医学杂志;2004年04期
8 王刚;吴小候;;Claudin-3在膀胱移行细胞癌中的表达及意义[J];重庆医学;2009年17期
9 张中伟;秦环龙;;肠上皮细胞紧密连接的结构及功能研究进展[J];肠外与肠内营养;2005年06期
10 张中伟;秦环龙;;乳酸菌对感染肠上皮细胞通透性及紧密连接蛋白表达的影响[J];肠外与肠内营养;2007年04期
中国重要会议论文全文数据库 前6条
1 崔岸;;HOWARV益生菌系列的生理功能研究[A];第三届“益生菌、益生元与健康研讨会”论文集[C];2004年
2 李国锋;侯连兵;任非;山本昌;;月桂酸对瑞巴派特经大鼠结肠粘膜透过性的影响[A];广东省药学会2007学术年会论文集[C];2008年
3 李国锋;孙亚彬;段炼;杨莉;唐中昆;侯连兵;;应用Ussing Chamber技术评价甘草与海藻的配伍对大鼠肠粘膜P-gp的影响[A];广东省药学会2009学术年会优秀论文[C];2010年
4 李国锋;孙亚彬;唐中昆;吴炳义;;甘草与甘遂配伍对大鼠肠粘膜药物转运体的影响[A];2010年广东省药师周大会论文集[C];2011年
5 伍丽萍;贺林;叶利明;;定量保留―活性关系体外预测模型的研究[A];四川省药学会第七次全省会员代表大会暨学术年会论文集[C];2011年
6 鄢良春;刘青春;赵军宁;毕岳琦;易进海;;小柴胡汤在Caco-2细胞模型的转运机制研究[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 赵祯;绿茶多酚对脑缺血大鼠血脑屏障的保护作用及机制的研究[D];中国医科大学;2009年
2 闫振贵;不同途径免疫NDV弱毒苗诱导鸡体黏膜和系统免疫反应的研究[D];山东农业大学;2011年
3 吕晓艳;癸酸钠增强黄连素对2型糖尿病治疗作用及机制研究[D];吉林大学;2011年
4 荣军博;全反式视黄酸(atRA)对人视网膜色素上皮(RPE)屏障功能影响的研究[D];中南大学;2011年
5 张锦华;猪源乳酸杆菌的筛选及其对仔猪肠道黏膜免疫影响的研究[D];南京农业大学;2011年
6 翟利娟;口服人参茎叶皂甙对鸡的疫苗免疫增强作用的研究[D];浙江大学;2011年
7 陈祎招;脑胶质瘤细胞对血脑屏障的作用及其分子机制[D];中国人民解放军第一军医大学;2003年
8 付超美;丹七缓释胶囊的研究[D];成都中医药大学;2004年
9 钟世顺;双歧杆菌分泌型粘附素体外调节肠上皮细胞生物学功能的实验研究[D];第一军医大学;2004年
10 蒋爱民;转lux基因发光乳球菌的构建及其生物学特性研究[D];西北农林科技大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 夏天;紧密连接蛋白CLAUDIN-1在大肠杆菌性腹泻仔猪胃肠组织中的表达及意义[D];华中农业大学;2010年
2 王玉红;卵巢上皮性癌组织中闭合蛋白-3和闭合蛋白-4的表达及其意义[D];郑州大学;2010年
3 吕亚宁;茶叶中主要特征成分在Caco-2细胞模型中吸收情况的研究[D];安徽农业大学;2010年
4 王小娜;产细菌素植物乳杆菌的初探及其应用[D];浙江工商大学;2011年
5 袁晶;植物乳杆菌作用及其应用初探[D];浙江工商大学;2011年
6 刘文跃;小儿急性肠梗阻肠粘膜免疫屏障损伤及细菌移位的研究[D];山西医科大学;2011年
7 郭子涛;表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在Caco-2细胞中的摄取、跨膜转运和外排研究[D];华东师范大学;2011年
8 吴安国;黄连厚朴配伍主要化学成分在Caco-2细胞模型中的吸收与转运研究[D];广州中医药大学;2011年
9 王海晶;丙酸杆菌素抑菌特性及其高产菌株发酵过程优化研究[D];吉林农业大学;2011年
10 张正东;Claudin-1和Claudin-10在肝细胞癌中的表达及意义[D];安徽医科大学;2011年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 郑德志;;鸡肠道中微生物区系与乳酸杆菌的应用[J];畜牧市场;2007年08期
2 朱珊珊;崔雯;任晓明;;乳酸杆菌黏附作用的研究进展[J];中国畜牧兽医;2009年07期
3 刘华,程金科,黄宗洲,杨玮云,徐中清;乳酸杆菌禽株(Lacto bacillace P.strain)的分离与试验[J];北京农学院学报;1991年01期
4 傅月华;;活菌制剂替代抗菌药物添加剂试验研究[J];浙江畜牧兽医;1993年03期
5 王淑敏,顾万钧,田来明,王宝东;Pro-suis益生素菌种特性分析[J];吉林农业大学学报;1995年04期
6 王红妹;马雪云;;禽用益生素乳酸杆菌菌株的分离筛选[J];家禽科学;2006年09期
7 张董燕;季海峰;王雅民;黄建国;单达聪;;鸡源乳酸杆菌M8最佳培养条件的确定及培养基优化[J];华北农学报;2007年02期
8 林雪彦;王中华;李福昌;彭军;苏鹏程;牛钟相;;乳酸杆菌黏附鸡消化道上皮细胞超微结构的观察[J];中国兽医学报;2008年12期
9 曾地刚;雷爱莹;;乳酸杆菌对罗非鱼生长和抗病力的影响[J];南方农业学报;2011年03期
10 韩亚超;宁豫昌;;1株猪源乳酸杆菌的分离鉴定与益生特性[J];江苏农业科学;2011年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王裴;陈传莉;李牧;王凤君;;肌球蛋白轻链激酶介导的缺氧后肠上皮屏障功能紊乱[A];第八届西南五省一市烧伤整形学术会议暨贵州省医学会烧伤整形分会2010年学术年会论文汇编[C];2010年
2 贾震易;秦环龙;;钙离子阻断剂防治肠上皮细胞缺血缺氧损伤的相关基因研究[A];中华医学会第十一届全国营养支持学术会议论文汇编[C];2008年
3 刘芳宁;Tammy Bui;杨增岐;;以轮状病毒感染的猪小肠上皮细胞为模型研究轮状病毒和益生菌对肠上皮细胞屏障功能的影响[A];第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛论文集(下册)[C];2010年
4 李晓鲁;彭毅志;袁志强;太光平;陈渝;;含人HSP72重组腺病毒制备及其在肠上皮细胞中的表达[A];全国烧伤创面处理、感染专题研讨会论文汇编[C];2004年
5 陈军;肖光夏;;烧伤血清对培养大鼠肠上皮细胞间黏附连接的影响[A];第五届全国烧伤救治专题研讨会烧伤后脏器损害的临床救治论文汇编[C];2007年
6 陈军;肖光夏;吴泽志;秦健;;烧伤血清刺激对大鼠肠上皮细胞粘弹性影响的初步研究[A];中华医学会第六届全国烧伤外科学术会议论文汇编[C];2001年
7 李晓鲁;袁志强;彭毅志;;重组腺病毒介导的HSP70转染对肠上皮细胞缺氧再复氧的保护作用[A];全国烧伤创面处理、感染专题研讨会论文汇编[C];2004年
8 彭曦;冯晋斌;尤忠义;王裴;汪仕良;;不同营养支持对烧伤大鼠肠上皮细胞线粒体呼吸功能的影响[A];全国烧伤创面处理、感染专题研讨会论文汇编[C];2004年
9 付凯飞;彭瑞云;;肠免疫组织对肠上皮细胞生长的影响[A];第七届全军防原医学专业委员会第五届中国毒理学会放射毒理专业委员会学术会议论文汇编[C];2004年
10 冯琳;郑婷;周小秋;刘扬;;维生素E对鲤鱼肠上皮细胞生长发育及抗氧化能力的影响[A];中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十次学术研讨会论文集[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 赵晴晴;非特异性阴道炎咋治疗?[N];健康时报;2003年
2 香红星;走进微生物世界让这个“小精灵”为你增效[N];中国畜牧兽医报;2007年
3 山西省临汾市尧都区畜牧兽医局吉灵记 杜青林;子猪早期断奶后常见问题及对策[N];中国畜牧兽医报;2008年
4 利华;老年人的理想饮品:酸奶[N];工人日报;2000年
5 李昕 王晖;重视药物吸收促进剂的毒性研究[N];中国医药报;2005年
6 曾林芝;护理阴道:无病时不用药[N];医药养生保健报;2005年
7 吕工;口服药物吸收促进剂研究[N];中国医药报;2003年
8 魏开敏;治细菌性阴道病联用乳酸杆菌制剂效更佳[N];大众卫生报;2007年
9 常怡勇;价廉身微的乳酶生[N];健康报;2006年
10 王敏 齐云;Caco-2细胞助力药物吸收促进剂研究[N];中国医药报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 庾庆华;肠上皮细胞紧密连接调节的研究[D];南京农业大学;2009年
2 曹力;乳酸杆菌对肉鸡肠道黏膜屏障功能的调节及机理[D];西北农林科技大学;2012年
3 杨永涛;Numb分子在肠粘膜屏障形成中的作用及其机制研究[D];第三军医大学;2012年
4 张锦华;猪源乳酸杆菌的筛选及其对仔猪肠道黏膜免疫影响的研究[D];南京农业大学;2011年
5 孙可一;乳酸杆菌的分离鉴定及其对炎症反应的免疫调节作用的研究[D];南京医科大学;2012年
6 张英春;抑制宋内志贺菌益生菌株的筛选及作用机制研究[D];哈尔滨工业大学;2011年
7 林雪彦;鸡消化道乳酸杆菌的黏附研究[D];山东农业大学;2006年
8 白爱平;益生菌抑制炎症性肠病肠道炎症反应的研究[D];四川大学;2004年
9 何海洋;轮状病毒与宿主细胞相互作用的研究[D];第三军医大学;2012年
10 柏干荣;失血性休克大鼠肠上皮细胞线粒体DNA COX基因、表达和功能改变及Rg1干预的研究[D];第三军医大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王侃;乳酸杆菌对细胞肿瘤坏死因子-α分泌的影响[D];浙江大学;2007年
2 孙建芝;益生菌对生殖道和肠道上皮细胞的粘附和粘附拮抗效应的研究[D];山东大学;2006年
3 袁芳芳;热打击致肠上皮细胞损伤机制的中西医研究[D];广州中医药大学;2012年
4 王国丽;肿瘤坏死因子-α对肠上皮细胞通透性的影响及机制研究[D];中南大学;2010年
5 刘行;HIF-1α在IFN-γ及TNF-α协同引起肠上皮屏障功能损害中的作用[D];第三军医大学;2011年
6 包海泉;益生菌制剂对家畜免疫促进作用的研究[D];内蒙古农业大学;2004年
7 陈雯莉;阴道乳酸杆菌对念珠菌生长抑制作用的研究[D];兰州大学;2008年
8 迟博;乳酸杆菌活菌制剂治疗细菌性阴道病疗效和安全性的系统评价[D];广西医科大学;2010年
9 徐栋花;乳酸杆菌对LPS诱导THP-1细胞炎症性细胞因子释放的调节作用及可能机制[D];南京医科大学;2011年
10 刘立恒;益生乳酸杆菌筛选和苹果渣发酵工程研究[D];中国农业科学院;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026