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《南京农业大学》 2009年
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棉花纤维发育相关基因的克隆分析及李氏突变体纤维发育早期的亚显微结构分析

孙磊  
【摘要】:棉花纤维是纺织工业的重要原料,在国民经济中占有重要地位。优良的纤维品质是世界棉花育种的主要目标之一。从细胞水平到分子水平阐明棉纤维发育的机理以及影响纤维品质的主要因素,具有重要的理论价值与现实意义。本研究的主要目的是利用透射电镜技术分析李氏超短纤维突变体(Li1li1)自交后代野生型(li1li1)和超短纤维突变型(Li1li1)纤维发育初期的亚显微结构,从亚细胞水平阐明纤维发育的机理。运用同源候选基因法克隆棉纤维伸长发育相关的两个基因,并对这两个基因做初步功能分析。对本实验室已克隆的GhCAS基因进行原核表达、亚细胞定位及Southern杂交分析。 1、借助透射电镜样品制备技术,观察李氏超短纤维突变型(Li1li1)自交后代野生型(li1li1)和超短纤维突变型(Li1li1) 0、1、3、5 DPA等纤维发育初期内部亚显微结构特征,旨在揭示棉纤维细胞分化与伸长的结构机理。通过分析发现,野生型和超短纤维突变型纤维发育初期的亚显微结构,3-5 DPA就有较大的不同。野生型的细胞内部结构较完整,有利于纤维的伸长发育。而突变型细胞内部结构不完整,因此阻碍了纤维细胞的伸长发育。 2、以棉花TM-1开花当天胚珠cDNA为模板,利用同源候选基因克隆法设计的PCR引物扩增棉花中BRICKI和WRM的同源基因,获得两个基因的全长序列,其中BRICKI全长433 bp包括完整的258bp的ORF编码85个氨基酸和一个终止密码子,根据同源性将其命名为GhBRICKI。qPCR分析发现该基因在根茎叶中以及纤维发育的各个时期中都有表达,表达高峰出现在开花后9 DPA的纤维。Southern杂交结果显示该基因在四倍体棉花TM-1中含有两个拷贝,转化酵母的结果表明,该基因显著促进了酵母细胞的极性伸长。 WRM全长1340bp包含一个完整的含1170 bp的ORF,编码389个氨基酸和一个终止密码子,命名为GhWRM。qPCR分析发现该基因在根茎叶中以及纤维发育的各个时期中都有表达,并且在根中的表达量高于茎和叶,表达的最高峰在开花后9 DPA的纤维。Southern杂交结果显示该基因在四倍体棉花TM-1中含有两个拷贝,转化酵母的结果表明,该基因显著促进了酵母细胞的极性伸长。 3、对本实验室克隆到的棉花β-氰丙氨酸合酶(P-cyanoalanine synthase, CAS, EC4.4.1.9)基因GhCAS (Gossypium hirsutum L. beta- Cyanoalanine Synthase mRNA)做进一步的研究,原核表达分析发现GhCAS基因的过量表达对原核生物的生长有抑制作用。通过蛋白质分离技术获得了GhCAS的表达蛋白。亚细胞定位结果显示该基因在细胞膜和细胞核中特异表达,而在细胞质中不表达。Southern杂交结果表明该基因在四倍体棉花中含有两个拷贝。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S562

【参考文献】
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