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《南京医科大学》 2010年
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同基因造血干细胞移植治疗1型糖尿病小鼠的疗效及机制研究

欧阳建  
【摘要】: 目的观察同基因造血干细胞移植治疗1型糖尿病(T1D)小鼠的疗效,观察不同的造血干细胞供鼠(正常供鼠及T1D供鼠)对疗效的影响,观察T1D小鼠发病到移植的时间对疗效的影响。 观察T1D小鼠外周血T淋巴细胞亚群、脾脏单个核细胞(MNC)中T调节细胞(Treg)的比例及其特征基因Foxp3 mRNA和Foxp3蛋白表达水平、树突状细胞亚群比例、胰岛β细胞功能及所继发的糖尿病肾病在造血干细胞移植前后的变化,探讨其在T1D的发生、发展中的作用,探讨同基因造血干细胞移植治疗1型糖尿病及糖尿病肾病的可能机制。 方法1、建立1型糖尿病小鼠模型:具体为雄性清洁级C57BL/6J雄性小鼠,连续五天腹腔注射链脲唑菌素(Streptozotocin, STZ)40-50mg/kg。连续两天空腹血糖 13.9 mmol/L的小鼠为建模成功。 2、分组:建模成功鼠分为移植供体组(19只)、移植受体组(50只)和病鼠对照组(25只)。另以14只正常小鼠设为正常对照组(NC组),31只正常小鼠设为正常供体组。正常鼠-病鼠移植组、病鼠-病鼠移植组为造血干细胞移植组。 3、同基因造血干细胞移植:移植组小鼠分别于成模后第3天、10天、20天、40天行同基因造血干细胞移植,预处理方案为60Coγ射线8Gy全身照射(TBI),然后由尾静脉分别输入正常或发病供体小鼠的骨髓细胞(约1×107)。部分病鼠对照组小鼠按照建模成功至处死时间不同分为,发病3日组(3d组,6只)、发病10日组(10d组,19只)、发病20日组(20d组,6只)和发病40天组(40d组,13只),其余病鼠对照组不作处理。分别于移植后30天处死正常对照组小鼠(6只)和发病10日移植受体组小鼠(6只),其余移植受体组小鼠(44只)和病鼠对照组小鼠(13只)于移植后120天处死。 4、研究指标观察及实验方法:移植受体组小鼠接受移植后在清洁级环境中饲养。每2周观察检测正常对照组、移植受体组和病鼠对照组小鼠血糖和尿糖的变化;取正常对照组,移植受体组和病鼠对照组小鼠胰腺行组织病理学检查;检测疗效明显组糖耐量变化;ELISA法检测各组小鼠血清胰岛素水平,免疫组化法半定量测定各组小鼠胰岛中胰岛素的表达;流式细胞仪测定移植后30天处死各组小鼠外周血淋巴细胞亚群及脾脏树突状细胞亚群比例(DC1/DC2);取移植后120天处死组小鼠脾脏,用流式细胞仪测定所有小鼠外周血T淋巴细胞亚群;取小鼠脾脏,聚合酶链反应(Real-time PCR)测定脾脏Foxp3 mRNA水平,Western blotting法测定脾脏Foxp3蛋白相对表达量。取移植后120天小鼠肾脏,分别检测肾脏病理,氧化应激水平以及血管紧张素原(AGT),单核细胞趋化因子-1 (MCP-1),转化生长因子β1(TGF-β1)的mRNA表达水平。 结果STZ注射两周后,成模小鼠血糖(21.24±6.14 mmol/L)明显高于正常小鼠血糖(6.71±2.35 mmol/L)(P 0.01)。发病十天组小鼠的胰腺病理学检查与正常对照组和移植组小鼠相比可见淋巴细胞浸润。 发病10天移植受体组小鼠移植后白细胞与血小板计数分别于第6日和第9日降到最低值。移植后30天,白细胞和血小板基本恢复正常,血糖逐渐下降至9.9±0.66 mmol/L;而此时发病40天组小鼠血糖为28.97±1.13 mmol/L (P 0.05)。与发病40天组小鼠相比,发病10天移植受体组小鼠糖耐量有明显改善,血清胰岛素水平和胰岛内胰岛素分泌显著升高。 与发病10天组病鼠相比,同基因造血干细胞移植后30天,移植受体组小鼠NK细胞比例、CD4/CD8比值和DC1/DC2比值下降(P 0.05),CD8+CD28-T细胞比例升高(P 0.05)。与发病40天组小鼠相比,移植受体组小鼠外周血NK细胞比例、CD5+CD19+B细胞比例、CD4/CD8比值和DC1/DC2比值下降(P 0.05)。 同基因造血干细胞移植后120天,发病10天组1型糖尿病小鼠血糖显著降低(移植后120天为(10.07±1.57)mmol/L,而1型糖尿病未治疗组为(26.08±3.87)mmol/L),并在120天的移植观察中未观察到再次升高,且造血干细胞来源(正常小鼠:n = 6,糖尿病小鼠:n = 7)对移植疗效无影响。该组移植后120天时糖耐量与糖尿病未治疗组相比有明显改善,血清胰岛素水平与正常对照组相比无统计学差异。移植及其后观察过程中未出现死亡,而糖尿病未治疗组有较高死亡率(5/13)。对于发病3天、20天、40天后移植组,在观察的120天中,尽管在移植后短期内降低了血糖,但随后血糖重新升高,并分别在移植后91天,77天超过13.9 mmol/L。该三组移植后120天时血糖均高(分别为(17.02±6.31 )mmol/L、(19.20±6.85)mmol/L、(28.48±7.16)mmol/L),且血糖超过13.9 mmol/L的受体小鼠比例逐渐升高(8/13,8/12,6/7),血清胰岛素水平逐渐降低((0.43±0.14) ug/mL, (0.33±0.12) ug/mL, (0.11±0.10) ug/mL)。在各组中,同基因造血干细胞移植对移植后小鼠的胰腺有明显保护作用,胰岛形态明显改善。 对于发病10天移植组,移植后120天Treg比例显著升高(P 0.01),Foxp3蛋白水平明显上升(P 0.05),Foxp3mRNA显著升高(P 0.01)。而发病3天、20天移植组移植后120天Treg、Foxp3蛋白、Foxp3mRNA均无上升,发病40天组尽管Foxp3mRNA水平增高(P 0.05),其Foxp3蛋白无上升,且Treg水平有显著降低(P 0.01)。对于1型糖尿病小鼠,发病后3天、10天、40天、90天、120天尽管在Foxp3蛋白和Foxp3mRNA水平未出现统计学差异,但与正常小鼠相比,Treg在发病3天组降低(P 0.05);发病10天组升高(P 0.05);发病20天组无差异,发病40天组降低。 在糖尿病发病初期对小鼠进行移植明显减轻了肾肥大。其中,对于发病10天移植组,肾小球肥大的缓解更为显著。同基因造血干细胞移植能阻止糖尿病引起的包括过氧化氢酶(CAT)、超氧阴离子(O2-)在内的氧化应激因子的变化,但对糖尿病引起的超氧化剂物歧化酶(SOD)的紊乱没有作用。移植能明显减轻糖尿病肾病在AGT和MCP-1mRNA水平上的增加,但不能减少TGF-β1mRNA的增高。 结论: (1)STZ多次性腹腔注射可以成功诱导出1型糖尿病小鼠模型。 (2)同基因造血干细胞移植(Syn-HSCT)可逆转1型糖尿病小鼠的高血糖和状态。此作用与小鼠发病至移植的时间有关。对发病10天的1型糖尿病小鼠,Syn-HSCT可持久逆转其高血糖状态,胰岛素分泌功能恢复,且有较好的安全性。对发病3天、20天、40天行Syn-HSCT,小鼠不能在移植后120天内维持血糖的降低,且随着发病至移植时间的增加,其疗效逐渐减弱。 (3)经同基因造血干细胞移植治疗后的发病10天的1型糖尿病小鼠,胰岛素分泌功能得到恢复;移植后30天外周血CD4/CD8比值和NK细胞比例降低,CD8+CD28-T细胞比例升高,脾脏DC1/DC2比值降低;移植后120天其Foxp3在细胞、蛋白、mRNA水平均升高,这可能是同基因造血干细胞移植治疗1型糖尿病小鼠的免疫学机制。 (4)用正常小鼠或用T1D小鼠做供体,对移植的疗效和移植后脾脏Treg细胞比例、Foxp3 mRNA、Foxp3蛋白水平的变化无影响。 (5)在糖尿病发病初期对小鼠进行同基因造血干细胞移植能明显减轻糖尿病引起的肾损害,这可能是通过维持氧化应激水平和控制AGT和MCP-1mRNA水平来达到的。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R587.1

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