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《南京医科大学》 2010年
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他汀类药物的肾保护研究

刘佳  
【摘要】: 随着慢性肾脏疾病(CKD)发病率的逐年上升,ESRD的发生率上升成必然趋势。导致CKD发生原因可以多种多样,但进展至ESRD的共同途径是肾脏纤维化。近几年来有关肾脏纤维化的发病机理及防治进展研究很多,虽然对已认识到的高血压,糖尿病,蛋白尿等危险因素制定了相应的治疗指南,但依然不能阻止的CKD上升趋势,说明许多研究还未能应用于临床,目前尚缺乏对CKD有效的防治措施。 目的: 1.探讨氟伐他汀对血管紧张素II诱导的肾小管上皮细胞增殖作用及其分泌纤维连接蛋白的影响。 2.研究氟伐他汀对糖尿病肾病小鼠保护作用。 3.探讨Rho激酶信号通路在糖尿病肾病间质纤维化中的作用及氟伐他汀保护机制 4.探讨氟伐他汀对高糖环境下HK2 klotho蛋白表达及细胞增殖与凋亡的影响及作用机制 方法: 1①不同浓度(10~(-9)-10~(-5) mol/L) AngII刺激体外培养的肾小管上皮细胞。②固定浓度AngII(10-6mol/L)刺激,不同浓度(10~(-9)-10~(-5) mol/L)氟伐他汀干预。③在不同的时间点(24h、48h、72h)用苯唑氮蓝法(MTT)检测细胞增殖。④固定浓度AngII(10~(-6)mol/L)刺激肾小管上皮细胞6、12、24、48、72、96小时,不同浓度(10_(-9)-10~(-5) mol/L)氟伐他汀干预48h,免疫印迹及细胞免疫荧光法检测纤维连接蛋白(FN)的表达。 2建立糖尿病小鼠模型,观察不同剂量氟伐他汀对肾重/体重比值、肾功能、蛋白尿、IL-6、FN、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、足细胞相关蛋白WT-1作用及影响。研究方法有生物化学法检查血尿素氮、肌酐、血糖、胆固醇、甘油三酯等,ELISA法检测尿白蛋白/肌酐比、IL-6,Western blot检测FN、α-SMA、WT-1,肾脏病理(光镜、免疫组化)观察肾脏病理改变及FN、α-SMA在肾组织分布及量的改变。 3①体外培养HK-2细胞,高糖刺激不同时间(6h、12h、24h),western blot检测p-MYPT1(磷酸化的Rho激酶)、FN表达。②.选择高糖12h作用点,观察不同剂量氟伐他汀干预后HK-2细胞p-MYPT1、FN表达。③.高糖培养HK2细胞12h,分别观察Rho激酶激动剂LPA、甲羟戊酸及其下游异戊二烯类化合物GGPP、FPP对中剂量氟伐他汀上述作用的影响。 4体外培养HK-2,观察高糖及不同浓度氟伐他汀、不同作用时间点对HK-2细胞增殖、凋亡及klotho、RhoA蛋白表达的影响,并观察分别合并MVA、FPP、GGPP对氟伐他汀作用klotho蛋白表达的影响。研究方法有苯唑氮蓝法(MTT)检测细胞增殖,Hoechst33258、检测细胞凋亡,western blot检测caspase-3、caspase-8、klotho、RhoA蛋白。 结果 1.①AngII促进肾小管上皮细胞增殖(P0.05),48小时作用最明显,且10~(-5)mol/L效果显著,随着浓度下降,促增殖作用下降。②氟伐他汀能够显著抑制AngⅡ的促增殖作用(P0.05),同样48小时抑制作用最明显,10~(-5)mol/L效果显著,随着浓度下降,抑制作用下降。③AngⅡ刺激肾小管上皮细胞12h后FN开始增加P0.01),72h到达高峰。氟伐他汀干预组与AngⅡ刺激(未干预)组比较,FN表达明显下降(P0.05),浓度10~(-5)mol/L下降最明显,10~(-6)mol/L次之,10~(-7)-10~(-9)mol/L抑制作用没有明显的差别。 2.①模型组血糖、尿白蛋白/肌酐、血尿素氮、肾重/体重比值、肾小球面积及系膜基质/肾小体面积比值,肾组织IL-6、FN、α-SMA检测均高于正常对照(P分别0.05、0.01),WT-1低于正常对照组(P0.05、0.01)。各剂量氟伐他汀干预1月时,尿白蛋白/肌酐、血尿素氮、肾重/体重比值、肾小球面积及系膜基质/肾小体面积比值、IL-6水平与非干预组相比有所下降,但无显著性差异(P0.05);FN、α-SMA较非干预组下降有显著差异(P0.01),WT-1较对照组比上升有显著性(P0.01)。中剂量连续干预2月和3月时,尿白蛋白/肌酐、血尿素氮、肾重/体重比值、肾小球面积及系膜基质/肾小体面积比值、IL-6、FN、α-SMA水平均明显低于非干预组(P分别﹤0.05、0.01); WT-1明显高于非干预组(P0.01)。②肾组织病理PAS显示糖尿病模型组小鼠肾小球面积和肾小体面积增大,随时间延长,系膜明显增生,细胞外基质显著增多。氟伐他汀干预后,与同期模型组小鼠相比,系膜增生及细胞外基质增多减轻。免疫组化病理显示模型组FN、α-SMA表达明显高于正常对照组,不同剂量氟伐他汀干预后FN、α-SMA表达较非干预组比均有明显下降(P0.05、0.01)。③整个实验期间,血胆固醇及甘油三酯水平各组间均无显著差异(P0.05)。 3.高糖刺激HK2细胞后各时间点均可引起p-MYPT1、FN表达显著增加,与0h相比(P分别0.05),p-MYPT1表达12h最高、FN 24h达高峰,呈时间依赖(P分别0.01)。不同剂量氟伐他汀(10~(-7), 10~(-6)和10~(-5) mol/L)干预后p-MYPT1和FN的表达均较未干预组降低,并呈浓度依赖性(P0.05)。甲羟戊酸和GGPP可以逆转氟伐他汀的上述作用,使p-MYPT1和FN上升(P0.05),而FPP则不能(P0.05)。LPA激动后可部分抵消氟伐他汀的上述作用,p-MYPT1、FN表达显著高于对照组(P0.05)。 4 HG培养HK-2至24~48h细胞增殖明显增加,与对照组比较P0.05,而培养至72h时细胞增殖开始降低,并低于对照组P0.05。高糖培养24~48h,细胞凋亡率及caspase3及caspase-8裂解片段增加(P分别0.05);高糖培养12h Klotho蛋白表达减少(P0.05)、RhoA蛋白表达增加(P0.05),均呈时间依赖性。不同浓度氟伐他汀(0.1、1、10μmol/L)不同时间(12、24、48、72h)均明显抑制细胞增殖(P0.05),细胞增殖抑制率具有时间-浓度依赖性。各浓度氟伐他汀(0.1、1、10μmol/L)均增加Klotho蛋白表达(P0.05)、减少RhoA蛋白表达(P0.05),呈浓度依赖性。减少细胞凋亡率及降低caspase-3、caspase-8的作用以浓度0.1、1、μmol/L明显(P0.05)。氟伐他汀对HK2klotho蛋白的表达上调作用可被MVA或GGPP逆转(P0.05),而FPP则不能(P0.05)。 结论 1氟伐他汀能抑制AngⅡ对肾小管上皮细胞的促增殖作用及促FN分泌作用,在一定范围内呈浓度依赖性。 2氟伐他汀可以降低糖尿病小鼠蛋白尿和血尿素氮,抑制糖尿病小鼠肾脏IL-6 FN、α-SMA的表达,促进足细胞WT-1的表达,减少系膜细胞和细胞外基质的增多,改善糖尿病早期肾损害,减少肾脏纤维化,其肾保护作用独立于降血脂。 3 Rho激酶可能是糖尿病肾病间质纤维化发生的起始信号之一,他汀类药物减少糖尿病肾病间质纤维化的作用机理与其抑制Rho激酶信号通路有关。 4高糖可减少HK2 klotho蛋白表达,并同时促进细胞增殖及凋亡。他汀可部分纠正高糖对HK-2的上述作用,其机理可能与通过抑制Rho信号通路,上调HK-2 klotho蛋白有关。此结果为他汀类药物在糖尿病肾病的治疗中提供新靶点有积极作用。小结糖尿病肾病肾病发病机制复杂,炎性介质、细胞因子、各种信号通路等网络效应形成对糖尿病肾病治疗的挑战。他汀类药物独立于抗Ras、抗炎、抗氧化、抗纤维化、上调klotho的多效性作用,有望成为糖尿病肾病治疗的有力措施之一。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R692

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