室旁核活性氧在慢性心力衰竭和肾血管性高血压发病机制中的作用研究

【摘要】：慢性心力衰竭(CHF)是严重危害人类健康的常见病。交感神经系统活动过度增强是该病的重要特征之一,是加速病情恶化并使存活期缩短的重要因素。CHF时心交感传入反射(CSAR)的病理性增强是导致交感活动亢进的重要原因之一,在CHF发病机制中起到极其重要的作用。我们前期的实验研究表明室旁核(PVN)中的血管紧张素II(AngⅡ)及AT_1受体活动异常在CHF大鼠CSAR增强的机制中起重要作用,正常大鼠PVN中NAD(P)H氧化酶来源的活性氧(ROS)尤其是超氧阴离子和过氧化氢介导CSAR。但是PVN中ROS是否介导CHF大鼠增强的CSAR,目前还不清楚。本研究采用结扎冠状动脉左前降支制作CHF模型,探讨PVN中的ROS是否介导CHF大鼠增强的CSAR以及AngⅡ引起的CSAR增强效应,为寻找新的防治CHF药物提供线索和奠定理论基础。 1.探讨PVN中的ROS是否介导CHF大鼠增强的CSAR。 2.探讨PVN中的ROS是否介导CHF大鼠AngⅡ引起的CSAR增强效应。 实验在体重300-400g,清洁级,雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠上进行。大鼠随机分为两组,慢性心力衰竭大鼠模型组(CHF组)和假手术对照组(Sham组)。大鼠自由摄食和饮水。急性动物实验于冠状动脉结扎手术或假手术后6-8周末进行。大鼠麻醉后去压力感受器神经支配,采用立体定位仪进行大鼠双侧PVN定位和核团微量注射药物,利用Powerlab生物信号采集系统在体记录肾交感神经放电活动(RSNA)、平均动脉压(MAP)和心率(HR)。以心室表面非梗死区应用缓激肽(BK)的方法引起CSAR,以BK引起的RSNA变化的百分率作为评价CSAR的指标。用化学发光法直接测定PVN中超氧阴离子水平,用硫代巴比妥酸法测定PVN中丙二醛(MDA)水平间接反映ROS水平。 1.PVN微量注射超氧阴离子清除剂tempol、tiron和SOD抑制剂DETC的效应 CHF大鼠和Sham大鼠随机各分为6组,每组6只,分别在PVN注射生理盐水、3种剂量的tempol (0.2、2和20 nmol)、tiron (10 nmol)以及DETC (10 nmol),观察其对CSAR、基础RSNA和MAP的影响。 2.PVN微量注射tempol、tiron和DETC预处理对PVN微量注射AngⅡ效应的影响 CHF大鼠和Sham大鼠随机各分为6组,每组6只,分别在PVN注射生理盐水、tempol (0.2、2和20 nmol)、tiron (10 nmol)以及DETC (10 nmol)预处理,观察其对PVN微量注射AngⅡ(0.3 nmol)引起的CSAR、基础RSNA和MAP增强效应的影响。 3.心室表面应用BK对PVN中超氧阴离子和MDA水平的影响CHF大鼠和Sham大鼠随机各分为2组,每组6只,分别在心室表面应用生理盐水或BK(0.4 ug),3分钟后立即断头取脑测定PVN中超氧阴离子水平和MDA含量。 4.PVN微量注射tempol、AngⅡ和AT_1受体拮抗剂losartan对PVN中超氧阴离子和MDA水平的影响 CHF大鼠和Sham大鼠随机各分为4组,每组6只,分别在PVN微量注射生理盐水、tempol (20 nmol)、AngⅡ(0.3 nmol)和losartan (10 nmol),3分钟后立即断头取脑测定PVN中超氧阴离子水平和MDA含量。 5.下丘脑前区微量注射tempol的效应 为了排除由于tempol扩散到脑的其他区域而起作用的可能,CHF大鼠和Sham大鼠各1组,每组3只,在靠近PVN的下丘脑前区微量注射tempol (20 nmol),观察对CSAR、基础RSNA、MAP和PVN微量注射AngⅡ效应的影响。 1. CHF大鼠的左心室梗死面积平均34%,心脏的重量以及心脏重量与体重之比明显增加;左心室收缩峰值压(LVSP)、左心室发展压(LVDP)和左室压力最大上升速率(LV +dP/dt_(max))降低,而左心室舒张末期压(LVEDP)增加。 2. CHF大鼠和Sham大鼠PVN微量注射超氧阴离子清除剂tempol或tiron均降低基础RSNA和MAP。而SOD抑制剂DETC增加基础RSNA和MAP,且CHF大鼠基础RSNA增加更明显。 3. CHF大鼠CSAR明显增强,PVN微量注射tempol或tiron均抑制增强的CSAR,大剂量tempol可完全阻断CSAR。而DETC进一步增强CSAR。 4. CHF大鼠和Sham大鼠PVN微量注射AngⅡ均增加基础RSNA和MAP,CHF大鼠基础RSNA增加更明显。大剂量的tempol和tiron阻断AngⅡ的效应。DETC并不能进一步加强AngⅡ的效应。 5. CHF大鼠和Sham大鼠PVN微量注射AngⅡ均增强CSAR,CHF大鼠效果更显著。Tempol剂量依赖性地抑制AngⅡ效应。Tiron和大剂量的tempol阻断AngⅡ的CSAR增强效应。DETC进一步加强CHF大鼠AngⅡ的CSAR增强效应。 6. CHF大鼠PVN中超氧阴离子和MDA水平显著增加。PVN微量注射tempol显著降低CHF大鼠PVN中升高的超氧阴离子和MDA水平。 7.心室外膜表面应用BK增加PVN中超氧阴离子和MDA水平,CHF大鼠增加更明显。 8. PVN微量注射AngⅡ增加PVN中超氧阴离子和MDA水平,CHF大鼠PVN中超氧阴离子和MDA水平升高更明显。AT_1受体拮抗剂losartan使得CHF大鼠PVN中增加的超氧阴离子和MDA水平恢复正常。 9. CHF大鼠和Sham大鼠靠近PVN的下丘脑前区微量注射tempol对CSAR和AngⅡ的增强效应无显著影响。 1. CHF大鼠CSAR明显增强,与PVN中ROS生成增多有关。 2.CHF大鼠PVN中ROS介导CSAR和AngⅡ的CSAR增强效应。 高血压病是严重危害人类健康的常见病,发病率高、治疗效果不够理想。众多研究表明各种原因引起的高血压病和各种高血压病的动物模型均有显著的交感神经系统活动过度增强特征。高血压时心交感传入反射(CSAR)的病理性增强是导致交感活动亢进的重要原因之一,在高血压发病机制中起到重要作用。我们前期实验研究表明室旁核(PVN)中的血管紧张素II(AngⅡ)及AT_1受体活动异常与两肾一夹(2K1C)肾血管性高血压大鼠CSAR增强机制有密切关系。但是介导高血压大鼠CSAR增强机制和AngⅡ增强效应的中枢机制还不明确。我们既往研究发现慢性心力衰竭(CHF)大鼠PVN中NAD(P)H氧化酶来源的活性氧(ROS)介导增强的CSAR和AngⅡ的增强效应。因此我们推测PVN中ROS同样介导2K1C肾血管性高血压大鼠增强的CSAR和AngⅡ的增强效应。本研究采用2K1C肾血管性高血压大鼠,探讨PVN中ROS在高血压大鼠CSAR增强机制中的作用,探讨PVN中ROS是否介导AngⅡ的增强效应;并探讨NAD(P)H氧化酶是否是介导CSAR和AngⅡ的增强效应的ROS生成的主要来源。 1.探讨PVN中ROS在高血压大鼠CSAR增强机制中的作用。 2.探讨PVN中ROS是否介导高血压大鼠AngⅡ的增强效应。 3.探讨PVN中NAD(P)H氧化酶是否是介导CSAR和AngⅡ增强效应的ROS的主要来源。 实验在体重300-350g,清洁级,雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠上进行。大鼠随机分为两组,肾血管性高血压大鼠模型组(2K1C组)和假手术对照组(Sham组)。大鼠自由摄食和饮水。急性动物实验于两肾一夹手术或假手术后4周末进行。实验在去压力感受器神经支配的麻醉大鼠上进行,采用立体定位仪进行大鼠双侧PVN定位核团微量注射药物,利用Powerlab生物信号采集系统在体记录肾交感神经放电活动(RSNA)、平均动脉压(MAP)和心率(HR)。以心室表面应用辣椒素的方法引起CSAR,以辣椒素引起的RSNA变化的百分率作为评价CSAR的指标。用化学发光法测定PVN中超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性。 1.PVN微量注射超氧阴离子清除剂tempol和SOD抑制剂DETC的效应 2K1C大鼠和Sham大鼠随机各分为3组,每组6只,分别在PVN注射生理盐水、tempol (20 nmol)以及DETC (10 nmol),观察其对CSAR、基础RSNA和MAP的影响。 2.PVN微量注射NAD(P)H氧化酶抑制剂apocynin的效应 2K1C大鼠和Sham大鼠随机各分为2组,每组6只,分别在PVN注射1%DMSO和apocynin (1 nmol),观察其对CSAR、基础RSNA和MAP的影响。 3.PVN微量注射tempol和DETC预处理对PVN微量注射AngⅡ效应的影响 2K1C大鼠和Sham大鼠随机各分3组,每组6只,分别在PVN注射生理盐水、tempol (20 nmol)以及DETC (10 nmol)预处理,观察其对PVN微量注射AngⅡ(0.3 nmol)引起的CSAR、基础RSNA和MAP增强效应的影响。 4.PVN微量注射apocynin预处理对PVN微量注射AngⅡ效应的影响 2K1C大鼠和Sham大鼠随机各分2组,每组6只,分别在PVN注射1%DMSO和apocynin (1 nmol)预处理,观察其对PVN微量注射AngⅡ(0.3 nmol)引起的CSAR、基础RSNA和MAP增强效应的影响。 5.心室表面应用辣椒素对PVN中超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性的影响 2K1C大鼠和Sham大鼠随机各分为2组,每组6只,分别在心室表面应用生理盐水或辣椒素(1 nmol),1分钟后立即断头取脑测定PVN中超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性。 6. PVN微量注射AngⅡ对PVN中超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性的影响 2K1C大鼠和Sham大鼠随机各分为2组,每组6只,分别在PVN微量注射生理盐水和AngⅡ(0.3 nmol),3分钟后立即断头取脑测定PVN中超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性。 1. 2K1C大鼠和Sham大鼠PVN微量注射超氧阴离子清除剂tempol或NAD(P)H氧化酶抑制剂apocynin均降低基础RSNA和MAP。而SOD抑制剂DETC增加基础RSNA和MAP,且2K1C大鼠基础RSNA增加更明显。 2.2K1C大鼠的血压升高,CSAR增强。2K1C大鼠和Sham大鼠PVN微量注射tempol或apocynin均阻断CSAR。而DETC进一步加强CSAR,且2K1C大鼠的效果更显著。 3.2K1C大鼠和Sham大鼠PVN微量注射AngⅡ增加基础RSNA和MAP,且2K1C大鼠增加效果更明显。Tempol或apocynin预处理可消除AngⅡ的效应。而DETC预处理进一步加强2K1C大鼠AngⅡ引起的基础RSNA和MAP增强效应。 4. PVN微量注射AngⅡ进一步增强2K1C大鼠和Sham大鼠的CSAR,且2K1C大鼠增强效果更明显。PVN微量注射tempol或apocynin预处理可消除AngⅡ引起的CSAR增强效应。而DETC预处理进一步增强2K1C大鼠PVN微量注射AngⅡ引起的CSAR增强效应。 5.2K1C大鼠PVN中超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性显著增加。 6.PVN微量注射AngⅡ增加PVN中超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性,2K1C大鼠效果更明显。 7.心室外膜表面应用辣椒素增加PVN中超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性,2K1C大鼠增加更明显。 1.PVN中ROS介导CSAR和PVN微量注射AngⅡ的增强效应。 2.2K1C高血压大鼠CSAR明显增强,其PVN中生成增多的ROS涉及高血压增强的CSAR机制。3.PVN中NAD(P)H氧化酶是参与调控CSAR的ROS生成的主要来源。 高血压时心交感传入反射(CSAR)的病理性增强是导致交感活动过度激活的重要原因之一,在高血压发病和病程进展过程中起到重要的作用。我们前期的实验研究表明室旁核(PVN)中的血管紧张素II (AngⅡ)及AT_1受体活动异常在2K1C大鼠CSAR增强机制中起重要作用,2K1C大鼠PVN中NAD(P)H氧化酶来源的活性氧(ROS)介导增强的CSAR和PVN微量注射AngⅡ的增强效应。据报导血管平滑肌细胞内c-Src(非受体型酪氨酸激酶)可以通过激活NAD(P)H氧化酶促进ROS生成,介导AngⅡ的生理效应。c-Src在中枢神经系统内广泛表达。但是PVN中c-Src是否与介导高血压大鼠增强的CSAR的ROS有关,并且c-Src是否参与调控高血压大鼠增强的CSAR以及AngⅡ效应目前还不清楚。本研究采用两肾一夹(2K1C)肾血管性高血压大鼠,探讨PVN中的c-Src是否参与调控高血压大鼠的CSAR增强机制以及是否介导AngⅡ的增强效应,并探讨高血压大鼠PVN中c-Src与NAD(P)H氧化酶和ROS在调控CSAR中的关系。 1.探讨PVN中c-Src是否参与2K1C高血压大鼠的CSAR增强机制。 2.探讨PVN中c-Src是否参与调控2K1C高血压大鼠AngⅡ的增强效应。 3.探讨PVN中c-Src与NAD(P)H氧化酶和ROS在调控CSAR和AngⅡ效应中的关系。 实验在体重300-350g,清洁级,雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠上进行。大鼠随机分为两组,肾血管性高血压大鼠模型组(2K1C组)和假手术对照组(Sham组)。大鼠自由摄食和饮水。急性动物实验于两肾一夹手术或假手术后4周末进行。实验在去压力感受器神经支配的麻醉大鼠上进行,采用立体定位仪进行大鼠双侧PVN定位核团微量注射药物,利用Powerlab生物信号采集系统在体记录肾交感神经放电活动(RSNA)、平均动脉压(MAP)和心率(HR)。以心室表面应用辣椒素的方法引起CSAR,以辣椒素引起的RSNA变化的百分率作为评价CSAR的指标。用化学发光法测定PVN中超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性。Western blotting法测定PVN中c-Src蛋白表达和c-Src活性。 1.PVN微量注射c-Src抑制剂PP2和SU6656的影响 2K1C大鼠和Sham大鼠随机各分为7组,每组6只,分别在PVN注射生理盐水、25%DMSO、4种剂量的PP2 (0.001、0.01、0.1和1 nmol)和SU6656 (0.5nmol),观察其对CSAR、基础RSNA和MAP的影响。 2.PVN微量注射PP2和SU6656预处理对PVN微量注射AngⅡ效应的影响 2K1C大鼠和Sham大鼠随机各分为7组,每组6只,分别在PVN注射生理盐水、25%DMSO、4种剂量的PP2 (0.001、0.01、0.1和1 nmol)和SU6656 (0.5 nmol)预处理,观察其对PVN微量注射AngⅡ(0.3 nmol)引起的CSAR、基础RSNA和MAP增强效应的影响。 3.PVN微量注射PP2对大鼠PVN中超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性的影响 2K1C大鼠和Sham大鼠随机各分为2组,每组6只,分别在PVN微量注射25%DMSO和PP2 (1 nmol),25分钟后立即断头取脑测定PVN中超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性。 4.PVN微量注射PP2预处理对PVN微量注射AngⅡ引起超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性变化的影响 2K1C大鼠和Sham大鼠随机各分为2组,每组6只,分别在PVN微量注射25%DMSO和PP2 (1 nmol),25分钟后PVN微量注射AngⅡ(0.3 nmol),3分钟后立即断头取脑测定PVN中超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性。 5.PVN微量注射PP2预处理对心室表面应用辣椒素引起超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性变化的影响 2K1C大鼠和Sham大鼠随机各分为2组,每组6只,分别在PVN微量注射25%DMSO和PP2 (1 nmol),25分钟后在心室表面应用辣椒素(1 nmol),1分钟后立即断头取脑测定PVN中超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性。 6.PVN微量注射AngⅡ对大鼠PVN中c-Src蛋白表达和c-Src活性的影响 2K1C大鼠和Sham大鼠随机各分为2组,每组6只,分别在PVN微量注射生理盐水和AngⅡ(0.3 nmol),3分钟后立即断头取脑测定PVN中c-Src蛋白表达和c-Src活性。 7.心室表面应用辣椒素对大鼠PVN中c-Src蛋白表达和c-Src活性的影响 2K1C大鼠和Sham大鼠随机各分为2组,每组6只,分别在心室表面应用生理盐水和辣椒素,1分钟后立即断头取脑测定PVN中c-Src蛋白表达和c-Src活性。 1.2K1C大鼠和Sham大鼠PVN微量注射c-Src抑制剂PP2或SU6656均降低基础RSNA和MAP,且2K1C大鼠降低更明显。 2.2K1C大鼠CSAR增强,PVN微量注射c-Src抑制剂PP2剂量依赖性抑制增强的CSAR。大剂量的PP2或SU6656阻断CSAR。 3.2K1C大鼠和Sham大鼠PVN微量注射AngⅡ均增加基础RSNA和MAP,且2K1C大鼠的效果更明显。PP2剂量依赖性抑制AngⅡ的效应。大剂量的PP2或SU6656阻断AngⅡ的增强效应。 4.虽然2K1C大鼠的CSAR已经增强,但是PVN微量注射AngⅡ进一步增强2K1C大鼠和Sham大鼠的CSAR,且2K1C大鼠效果更明显。PP2剂量依赖性地抑制AngⅡ的效应。PVN微量注射大剂量PP2和SU6656均阻断AngⅡ引起的CSAR增强效应。 5.2K1C大鼠PVN中c-Src活性和NAD(P)H氧化酶活性升高,超氧阴离子水平显著增加,而2K1C大鼠和Sham大鼠c-Src蛋白表达没有显著差异。2K1C大鼠PVN微量注射大剂量PP2明显降低升高的NAD(P)H氧化酶活性和超氧阴离子水平。 6.2K1C大鼠和Sham大鼠PVN微量注射AngⅡ均增加PVN中c-Src活性和NAD(P)H氧化酶活性,升高超氧阴离子水平,且2K1C大鼠效果更强。AngⅡ对c-Src蛋白表达没有显著影响。PVN微量注射大剂量PP2预处理阻断AngⅡ的增加效应。 7.2K1C大鼠和Sham大鼠心室外膜表面应用辣椒素均增加PVN中c-Src活性和NAD(P)H氧化酶活性,升高超氧阴离子水平,且2K1C大鼠效果更强,但对c-Src蛋白表达没有显著影响。PVN微量注射大剂量PP2预处理阻断心室外膜表面应用辣椒素的效应。 1.PVN中c-Src活性升高参与调控高血压大鼠增强的CSAR机制。 2.PVN中c-Src参与调控高血压大鼠AngⅡ的增强效应。 3.PVN中c-Src通过激活NAD(P)H氧化酶促进ROS生成参与调控CSAR和AngⅡ的效应。

【关键词】：心交感传入反射 慢性心力衰竭 血管紧张素Ⅱ 室旁核 活性氧 心交感传入反射 肾血管性高血压 血管紧张素Ⅱ 活性氧 NAD(P)H氧化酶 肾血管性高血压 血管紧张素Ⅱ c-Src 活性氧 NAD(P)H氧化酶
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R541.6
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