MiR-145对乳腺肿瘤生长和新的血管生成的影响的研究

【摘要】：目前,肿瘤是人类第一大杀手,对人类的生存构成最严重的威胁。乳腺癌是全球妇女中发病和死亡率占继肺癌之后第二位的恶性肿瘤。由于肿瘤发生的异质性,乳腺癌发病机制存在许多因素,并且乳腺癌具有容易转移的特点,目前手术仍是治疗乳腺癌的重要手段。探索肿瘤发病的机制对肿瘤的诊断、治疗和手术后预防有非常重要的意义。MicroRNA(miR)是近年来发现的一类在转录水平调控基因表达的长度约17-22个左右的核苷酸分子,通过与靶基因mRNA3’-UTR区域配对调控基因的表达。它不仅在时空上调控动物的发育,而且在肿瘤中miR常异常表达,起到癌基因或抑癌基因的作用,参与调控肿瘤的发生发展转移。MiR-145靶向多个基因,但是miR-145调节肿瘤生成和新的血管的作用还有待于研究。 肿瘤发生早期直径仅为1～2毫米时就需要新的血管生成用以提供生长所需的物质,否则就无法继续生长而死亡,血管内皮生长因子VEGF在肿瘤新的血管生成中起重要作用。正常人体已形成完整的血管系统,不需要有新的血管生成。抑制新的血管生成对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用,但是迄今为止还未见miR-145在肿瘤形成和新的血管生成中的作用的的报道。本实验目的是探究miR-145作为抑癌基因是否抑制了肿瘤血管的发生;研究miR-145抑制肿瘤细胞生长的新的机制为肿瘤抗血管治疗提供理论基础。MiR-145在乳腺癌中的表达检测 首先本实验验证了miR-145在乳腺癌中的表达情况。通过Stem-loop实时定量RT-PCR方法我们检测到miR-145在乳腺癌中的表达量比正常组织低,这与文献报道的一致。 过表达miR-145乳腺癌稳定株的建立 我们利用慢病毒表达载体建立了高表达miR-145的乳腺癌稳定株:Lenti-miR-145-MDA-MB-231与Lenti-miR-145-MCF-7。这两株细胞与阴性对照细胞株相比miR-145的表达量较高。 MiR-145体外抑制了乳腺癌细胞的生长和肿瘤血管的发生 通过细胞计数、软琼脂克隆形成实验发现miR-145高表达的乳腺癌稳定株细胞生长慢。当包含VEGF的全长启动子报告基因质粒转染到稳定株内,miR-145下调了报告基因的读值;半定量RT-PCR方法检测VEGF表达水平发现与阴性对照相比,稳定株的VEGF的转录水平下调。说明miR-145与肿瘤血管发生相关。将含VEGF启动子区与HIF-1a结合位点的报告基因转到稳定株内,miR-145同样降低了荧光素酶的活性,说明MiR-145可能通过HIF-1a和VEGF抑制了肿瘤血管的发生。 MiR-145靶向BCL2L2和DDR1抑制了乳腺癌细胞的生长通过软件分析,miR-145分别与BCL2L2、DDR1 3’-UTR区域存在配对区域。我们构建了这两个预测靶基因的mRNA 3’-UTR的报告基因质粒。将报告基因质粒与miR-145的表达质粒共转到293T细胞,与阴性对照组相比,miR-145明显下调了报告基因的水平。乳腺癌中的BCL2L2、DDR1的蛋白水平比正常组织高并且与miR-145的表达水平呈负相关。我们进步检测了乳腺癌稳定株内靶基因的表达水平,发现过表达miR-145的乳腺癌稳定株内BCL2L2与DDR1的蛋白水平比对照组下调。说明miR-145靶向BCL2L2、DDR1。现已知肿瘤的凋亡是促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白协同作用,两者存在竞争抑制作用。BCL2L2具有抗凋亡功能,将miR-145过表达后,miR-145通过减弱抗凋亡信号而抑制了肿瘤的凋亡,从而减慢了细胞的生长。DDR1在多种肿瘤中上调,是重要的癌基因,能促进细胞迁移,抑制细胞凋亡。我们用DDR1的干扰RNA将其干扰后,磷酸化Caspas-3上调,说明在乳腺癌中DDR1起到抑制凋亡的功能。MiR-145是目前最早能调控DDR1的miR。许多文献报道miR-145能促进细胞凋亡,但是机制还不清楚,本实验首次发现miR-145的促凋亡机制。 MiR-145靶向N-Ras抑制了肿瘤血管的发生 实验中我们发现miR-145能明显下调VEGF的mRNA、VEGF启动子全长报告基因、VEGF的HIF-1a报告基因的水平。通过Western Blot检测发现miR-145通过PI3K/AKT信号通路下调了VEGF。目前已报道的miR-145的靶基因如IRS1和IGF-1R,它们作为PI3K的上游调控该信号通路。过表达miR-145的乳腺癌细胞稳定株内我们也检测到IRS1蛋白水平下调。通过软件分析我们发现N-Ras 3’-UTR区域也存在于miR-145的配对位点,由此我们构建了含N-Ras 3’-UTR的报告基因质粒,发现miR-145也能下调N-Ras报告基因质粒的水平。乳腺肿瘤组织N-Ras的蛋白水平比正常组织高,并且miR-145的表达水平也与N-Ras存在负相关。N-Ras在两株过表达miR-145的乳腺癌细胞中的表达呈下调趋势,因此N-Ras是miR-145的靶点。N-Ras作为PI3K的上游调控磷酸化AKTVEGF的表达。 MiR-145抑制了乳腺癌动物模型的肿瘤的生长和肿瘤血管发生 为进步验证miR-145在体内的功能,我们将Lenti-miR-145-MDA-MB-231细胞接种到裸鼠皮下,经过3周与对照组相比过表达miR-145的肿瘤组肿瘤较小、血红蛋白含量低、肿瘤血管较少;DDR1、BCL2L2与N-Ras蛋白水平下调。说明体内miR-145抑制了肿瘤的生长和血管发生,这也是目前关于miR-145抑制肿瘤血管发生的首次报道。

【关键词】：miR-145 BCL2L2 DDR1 N-Ras VEGF PI3K AKT HIF-1α
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R737.9
【目录】：