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《南京医科大学》 2010年
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基于DNA免疫的乙型肝炎病毒表面抗原大中小蛋白的免疫原性研究

沈美龙  
【摘要】: 目的观察乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)大蛋白(LHBs),中蛋白(MHBs)和小蛋白(SHBs)DNA疫苗的免疫原性,分析其免疫应答模式及机制,为研究开发免疫原性更优的乙型肝炎病毒(HBV)预防或治疗性疫苗提供理论依据。 方法我们设计了HBV adr亚型HBsAg共识基因(consensus S gene for HBV adr subtype,adr-S-Cons),并据此构建了乙肝病毒LHBs,MHBs和SHBs DNA疫苗,经酶切和基因测序鉴定其构建正确;肌肉注射、活体基因导入方式分别对Balb/c小鼠分别进行LHBs,MHBs和SHBs DNA疫苗免疫,第0、2和4周共免疫3次,于每次免疫前和末次免疫后每两周收集血清;ELISA和Western blot法检测LHBs,MHBs和SHBs DNA疫苗表达产物与三种DNA疫苗免疫血清之间的相互识别;酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测LHBs,MHBs和SHBs免疫小鼠的抗原特异性抗体分泌细胞(ASCs)检测;同法检测LHBs,MHBs和SHBs免疫小鼠的抗原特异性细胞因子(IFN-γ、IL-2)分泌细胞。 结果1. DNA质粒经双酶切,可见分子量约1200bp、850bp及700bp的插入基因片段,与LHBs、MHBs、SHBs预期大小相符,测序结果与设计序列进行比对,两者吻合率为100%。 2. Western blot法检测结果表明,三种DNA疫苗的小鼠免疫血清对LHBs、MHBs和SHBs抗原成分均有一定程度的识别。 3.第一次免疫后两周3个实验组(LHBs、MHBs和SHBs免疫组)小鼠血清以ELISA法均能分别检测到抗商品化HBsAg、LHBs、MHBs和SHBs的特异性抗体。在第三次免疫后两周,3个实验组抗商品化HBsAg、LHBs、MHBs和SHBs的抗体滴度达峰值。LHBs、MHBs和SHBs DNA疫苗免疫后小鼠抗血清与商品化HBsAg抗原的结合能力,以SHBs抗血清最强,MHBs次之,LHBs再次之;与LHBs抗原的结合能力,以MHBs免疫后血清最强;与MHBs抗原的结合能力,以MHBs抗血清最强,SHBs次之,LHBs再次之;与SHBs抗原的结合能力,以MHBs和SHBs免疫后血清为高。 4.抗原特异性ASCs检测结果显示,商品化HBsAg抗原特异性ASCs数量在LHBs、MHBs和SHBs免疫组三组间两两比较均有显著性差异,P0.05,以SHBs组每107细胞中ASC数量最多,MHBs次之;LHBs抗原特异性ASC检测,LHBs、MHBs和SHBs三组间两两比较均无统计学差异,P0.05;MHBs抗原特异性ASCs检测,LHBs、MHBs和SHBs三组间比较,LHBs与其他两组比较均有显著性差异,P0.01,MHBs组抗原特异性ASCs数量最多,MHBs和SHBs组间比较无统计学差异,P0.05;SHBs抗原特异性ASCs检测,LHBs、MHBs和SHBs三组间两两比较均无统计学差异,P0.05,但以MHBs组抗原特异性ASCs数量为多。 5. LHBs,MHBs和SHBs DNA疫苗免疫小鼠的抗原特异性IFN-γ、IL-2分泌细胞检测表明,这两种细胞因子的分泌细胞数量在LHBs、MHBs和SHBs三组中比较,均无统计学差异,P0.05。 结论1、本研究构建的乙肝病毒LHBs、MHBs和SHBs三种DNA疫苗均能在小鼠体内诱导产生相应的免疫应答。 2、LHBs、MHBs和SHBs DNA疫苗对Balb/c小鼠的免疫原性有所不同,差别主要在体液免疫方面,而T细胞免疫方面未见明显差异。 3、比较LHBs、MHBs或SHBs三种DNA疫苗的免疫原性,在本实验体系中,以含preS2区的MHBs DNA疫苗为最强,SHBs次之,LHBs最弱。 4、鉴于MHBs DNA疫苗的良好免疫原性和HBV pre-S区免疫应答对HBV感染防治的重要意义,应将MHBs抗原列为重要的乙肝疫苗候选抗原。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R392

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