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《南京医科大学》 2009年
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风疹病毒(RV)包膜糖蛋白E1特异基因片段的原核表达

曹晶  
【摘要】:风疹病毒(rubellavirus,RV),又称德国麻疹病毒,是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员,与披膜科的其它病毒无交叉抗原。RV是TORCH综合征病原体(巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、风疹病毒、弓形虫)之一,是重要的胎儿致畸因子,可以通过胎盘感染胎儿,导致新生儿患上先天性风疹综合征(congenitalrubellasyndrome,CRS),可表现为白内障、耳聋、心脏病或智力发育障碍。孕妇感染RV越早,新生儿患CRS的机率越大。RV也是男性不育的影响因子,男性生殖系统感染TORCH,可引起睾丸炎、附睾炎、前列腺炎等,以及男性不育。 目前,免疫学检测手段一直是广泛应用于RV感染的临床诊断方法,如血凝抑制试验(HIA),特异性抗体IgM、IgG及RV蛋白抗原的检测等。RV感染的筛查主要基于ELISA法检测特异性的血清IgM型抗RV抗体,检测试剂盒几乎完全依赖于进口,价格昂贵,很难适合于临床实验室常规开展。抗RV抗体检测结果的准确性依赖于相应的抗原制剂,因此,抗原的特异性决定了检测结果的准确性。尽管RV的主要三种结构蛋白——包膜糖蛋白E1、E2和衣壳蛋白C都有着较高的免疫原性,在人体内可诱发强烈的抗体应答。其中E1包括RV的大部分血凝抑制区和免疫抗原表位,且经研究表明E1基因序列株间变异程度与全株序列变异程度相近,而E2蛋白的生物学作用尚不清楚,衣壳蛋白C主要与病毒复制有关,后者因存在交叉抗体应答限制了其作为诊断的特异性抗原。因此,RV的3种结构蛋白中,E1蛋白最适合作为基因工程抗原用做免疫性诊断试剂和疫苗的研制。 本研究从麻疹、腮腺炎及风疹三联减毒活疫苗中提取了RV的基因组RNA,将其逆转录为cDNA,便于对其基因组保存及进一步扩增目的基因。而后通过基因工程方法表达E1基因保守性好、免疫原性高的氨基端196-305位氨基酸的肽段E1-N。用PCR扩增得到编码E1-N的基因片段,插入原核表达载体pGEX-2T质粒中,构建成表达E1-N的重组质粒pGEX-2T/E1-N,经双酶切和测序鉴定证实后,将该质粒转化E.coliBL21菌株,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,分别于16℃和37℃下诱导表达融合蛋白,得到结果:在16℃诱导下表达的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)与E1-N的融合蛋白主要存在于上清中;而37℃诱导下的融合蛋白主要存在于包涵体中。通过谷胱甘肽琼脂糖珠亲和层析获得纯化的GST/E1-N融合蛋白。 通过以上研究,我们扩增的包膜糖蛋白的E1特异基因序列,经测序证实与GenBank上所报道的基因序列一致,用IPTG诱导重组表达质粒pGEX-2T/E1-N表达重组融合肽段时,IPTG的最佳浓度为1mmol/L,最佳诱导时间为5h,最佳诱导温度为16℃。低温诱导可以避免包涵体的形成,重组融合蛋白以可溶性形式表达于上清中,从而避免了对重组融合蛋白的变性和复性过程,大大简化了操作。因此,本研究表达的E1特异蛋白为进一步研制特异性RV检测试剂盒和开发新型基因工程疫苗提供了实验依据和方法基础。
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