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《南京医科大学》 2009年
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小鼠HSP10基因siRNA和超表达重组腺病毒载体构建及其对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的作用

凌静  
【摘要】:目的:热休克蛋白10(heat shock protein 10,HSP10)又称CPN10、GROES或HSPE1,属于小分子热休克蛋白家族成员,主要作为一种分子伴侣蛋白,与HSP60协同,在蛋白质折叠中发挥作用;HSP10还参与细胞周期调控、核质运输和新陈代谢。我们的前期研究发现,HSP10蛋白水平在多囊卵巢综合征患者卵巢组织中的表达明显低于正常人卵巢组织。但是,有关HSP10蛋白在多囊卵巢综合征发生发展过程中的作用尚未有过报道。本研究通过构建小鼠HSP10基因siRNA和超表达重组腺病毒载体及体外培养小鼠卵巢颗粒细胞,实现HSP10基因在小鼠卵巢颗粒细胞中的表达抑制和超表达;观察改变HSP10基因表达后卵巢颗粒细胞的凋亡。通过该研究,探讨HSP10在卵巢颗粒细胞中的生理功能,并为研究HSP10在多囊卵巢综合征病理生理机制中的作用提供依据。 方法: (1)根据siRNA靶序列设计2条互补的64bp寡核苷酸,构建穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA,再与穿梭质粒pAdTrack-CMV进行连接,构建穿梭质粒pATC-H1-siRNA。pATC-H1-siRNA经酶切和测序鉴定后,通过“两步转化法”分别将腺病毒骨架质粒pAdeasy-1和穿梭质粒pATC-H1-siRNA转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组得到AdCMV-H1-siRNA/HSP10重组腺病毒质粒。继而通过脂质体转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。AdCMV-H1-siRNA/HSP10转染AD-293细胞收集的病毒上清,重复感染AD-293细胞四次,实现病毒大量扩增。(2)用RT-PCR的方法从小鼠卵巢组织中扩增HSP10基因全长,克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdTrack-HSP10。分别将腺病毒骨架质粒pAdeasy-1和穿梭质粒pAdTrack-HSP10转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组得到AdCMV-HSP10重组腺病毒质粒。通过脂质体转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。转染后用收集的病毒上清重复感染细胞,实现病毒大量扩增。(3)每只标准克小鼠腹腔注射PMSG48小时后,取出双侧卵巢,获得卵母细胞核卵丘细胞,加入透明质酸酶消化使颗粒细胞与卵母细胞分离,以相同密度接种入6孔培养板,置于37℃、5%CO2培养箱中。(4)将AdCMV-H1-siRNA/HSP10及AdCMV-HSP10重组腺病毒直接加入培养液中感染小鼠卵巢颗粒细胞。病毒感染小鼠卵巢颗粒细胞48小时后分别提取蛋白,通过Western blot的方法验证HSP10在颗粒细胞中的表达抑制和超表达,应用流式细胞术、TUNEL法检测颗粒细胞的细胞凋亡。 结果: (1)穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA经双酶切与测序证实构建成功,进一步与pAdTrack-CMV连接,构建穿梭质粒pATC-H1-siRNA,构建成功了HSP10基因的siRNA重组腺病毒质粒pAdCMV-H1-siRNA/HSP10和对照质粒pAdCMVH1-siRNA/control。重组质粒转染AD-293细胞后经过包装、扩增最终得到高滴度重组病毒,以GFP为标志测定AdCMV-H1-siRNA/HSP10病毒滴度为109 U/ml,AdCMVH1-siRNA/control病毒滴度为108 U/ml。(2)从小鼠卵巢组织中扩增出309bp的cDNA,测序证实为小鼠HSP10基因。在此基础上,通过BJ-5183细菌内同源重组的方法构建了HSP10基因的重组腺病毒质粒AdCMV-HSP10及对照质粒AdCMV。重组质粒转染AD-293细胞后经过包装、扩增最终得到高滴度重组病毒,以GFP为标志测定AdCMV-HSP10病毒滴度为107 U/ml,AdCMV-GFP病毒滴度为108 U/ml。(3)成功进行了小鼠卵巢颗粒细胞的体外培养,实现了HSP10在小鼠卵巢颗粒细胞内表达抑制和超表达。与对照组相比,在HSP10表达抑制组中蛋白的表达水平明显降低,两组间差异显著(p0.05)。同时,与对照组相比,在HSP10超表达组中蛋白的表达水平明显升高,两组间差异显著(p0.05)。(4)用细胞流式术、TUNEL法检测了HSP10表达抑制和超表达后颗粒细胞的细胞凋亡,结果显示:与对照组相比,表达抑制组中细胞凋亡率明显增加,两组间差异显著(p0.05);超表达后,颗粒细胞的细胞凋亡明显减少,两组间差异显著(p0.05)。 结论:(1)小鼠HSP10基因siRNA和超表达重组腺病毒载体的构建为进一步研究HSP10在PCOS发生发展中的作用及其机制提供了实验基础。(2)HSP10在小鼠颗粒细胞内表达抑制后明显促进了细胞的凋亡;超表达后颗粒细胞的细胞凋亡明显减少。表明HSP10与颗粒细胞凋亡的生理机制相关。(3)从课题组前期结果和本文结果推论,在PCOS发生发展中卵巢HSP10表达降低,进而诱导了颗粒细胞的凋亡。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R363

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前3条
1 孙春玲;乔杰;陈英玉;张婷;胡振兴;;体外受精-胚胎移植中多囊卵巢综合征颗粒细胞凋亡与妊娠结局关系的探讨[J];中国实用妇科与产科杂志;2007年09期
2 金佳丽;王勇;吴效科;;卵泡发育异常与多囊卵巢综合征的关系[J];中华妇幼临床医学杂志;2008年02期
3 张娟;朱桂金;王昕荣;徐蓓;胡琳莉;;硫酸普拉睾酮钠诱导大鼠多囊卵巢综合征动物模型的实验研究[J];中国优生与遗传杂志;2007年02期
【共引文献】
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1 朱光宇;罗格列酮的临床应用进展[J];安徽医药;2005年09期
2 程志清;石占利;黄科;杨雨民;周佳;;胰岛素和瘦素抵抗与高血压肥胖相关性的实验研究[J];浙江中医学院学报;2006年01期
3 卢巧英;赵巧萍;;祛痰通络方治疗2型糖尿病胰岛素抵抗的临床观察[J];浙江中医药大学学报;2008年03期
4 蔡平平;张玉珍;;活血化瘀方药对Poresky大鼠模型内皮细胞的影响[J];浙江中医药大学学报;2009年04期
5 杨秀梅;;自拟“燥湿化痰汤”配合二甲双胍治疗2型糖尿病胰岛素抵抗的疗效观察[J];浙江中医药大学学报;2011年01期
6 董荣芬,苗桂珍,朱学敏,李春桂,董宝杰,缪娟,王宝玉;中老年2型糖尿病胰岛素敏感指数与中医辨证分型的研究[J];北京中医;2005年05期
7 李莉芬;吴玉红;;健脾化痰活血法改善2型糖尿病胰岛素抵抗的临床观察[J];北京中医;2006年07期
8 宋守君,张颖,王琳,朱玉琴,邢绍芝;糖耐量减低患者胰岛素抵抗与颈动脉粥样斑块的相关性分析[J];滨州医学院学报;2003年06期
9 陈明;;胰岛素抵抗高血压的发病机制研究[J];长春中医药大学学报;2009年03期
10 邓姝;何贵翔;;多囊卵巢综合征高雄激素血症动物模式构建及中药治疗机制研究[J];长春中医药大学学报;2012年03期
中国重要会议论文全文数据库 前7条
1 冯建华;;化痰活血法治疗Ⅱ型糖尿病胰岛素抵抗的临床研究[A];2011年中华名中医论坛暨发挥中西医优势防治肿瘤高峰论坛论文集[C];2011年
2 童珊珊;闵苏;魏珂;张光新;;体外循环对兔骨骼肌葡萄糖转运蛋白4和胰岛葡萄糖转运蛋白2的影响[A];第十五次长江流域麻醉学学术年会暨2010年中南六省麻醉学学术年会暨2010年湖北省麻醉学学术年会论文集[C];2010年
3 陈刚;夏燕萍;俞茂华;陈雯洁;;老年代谢综合征血清游离脂肪酸、氧化低密度脂蛋白水平的变化和相关分析[A];2009年中国药学大会暨第九届中国药师周论文集[C];2009年
4 陈刚;夏燕萍;俞茂华;陈雯洁;;老年代谢综合征血清游离脂肪酸、氧化低密度脂蛋白水平的变化和相关分析[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
5 丁耀耿;郝桂霞;;糖尿病肾病临床分析[A];全国第二届中医中西医结合肾脏病临床进展学术研讨会论文集[C];2007年
6 陈景海;宋晓武;王怡淳;曾向村;王军;季晓君;赵汤艳;王小青;;罗格列酮对老年原发性高血压伴糖尿病患者血压的影响[A];浙江省中西医结合学会糖尿病专业委员会第一次学术会议材料汇编[C];2006年
7 谢阳;黄冬梅;陆付耳;徐丽君;邹欣;龚菂;;补肾通脉方对伴胰岛素抵抗的多囊卵巢综合征大鼠InsR及IRS-1表达的作用[A];第八届全国中西医结合妇产科学术大会论文及摘要集[C];2012年
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1 韩玉萍;糖尿病双生子肾虚血瘀证的表观遗传研究[D];成都中医药大学;2010年
2 佟庆;归术益坤汤治疗多囊卵巢综合征的临床与实验研究[D];北京中医药大学;2011年
3 李梅;孤儿核受体NR4A1在多囊卵巢综合征病理生理机制中作用的研究[D];南京医科大学;2011年
4 鞠传霞;壳寡糖抗2型糖尿病的作用及机制[D];青岛大学;2011年
5 陈大庆;创伤性脑损伤大鼠RSTN基因表达特征及RSTN对创伤后胰岛素敏感性的影响作用[D];华中科技大学;2012年
6 易玮;针刺对胰岛素抵抗干预作用的研究[D];广州中医药大学;2002年
7 孙永生;卵巢Ⅱ号对多囊卵巢大鼠垂体、肾上腺及卵巢作用的实验研究[D];黑龙江中医药大学;2002年
8 唐迎雪;祛痰活血解毒法对2型糖尿病胰岛素抵抗作用的研究[D];山东中医药大学;2003年
9 李琳琳;膳食因素和Calpain-10基因与维吾尔族哈萨克族2型糖尿病[D];新疆医科大学;2003年
10 邓宏明;脂联素与体脂含量、分布及胰岛素敏感性的相关研究[D];重庆医科大学;2003年
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1 李岚;补肾化瘀方对PCO大鼠卵巢颗粒细胞上EGFR、TGFR基因表达的影响[D];湖南中医药大学;2010年
2 熊娟;补肾化瘀方对PCO模型大鼠卵巢颗粒细胞MMP-2、MMP-9基因表达的影响[D];湖南中医药大学;2010年
3 徐玉芬;生精汤去多糖处理对PCOS大鼠促排卵作用的实验研究[D];浙江中医药大学;2010年
4 马育轩;西洋参干预胰岛素抵抗脂肪细胞模型物质基础的研究[D];黑龙江中医药大学;2010年
5 杨娜;胰岛素受体底物1的表达及酪氨酸磷酸化与子痫前期病人胰岛素抵抗关系的研究[D];泰山医学院;2010年
6 郭晓洁;益气解毒汤对肥胖型2型糖尿病患者胰岛素抵抗的干预性临床研究[D];山东中医药大学;2010年
7 张倩;降浊调脂方治疗2型糖尿病并发高脂血症的临床研究[D];山东中医药大学;2010年
8 杨东;不同方式干预对2型糖尿病胰岛素抵抗的影响[D];山东中医药大学;2008年
9 耿以安;胰康合剂治疗2型糖尿病胰岛素抵抗的临床研究[D];山东中医药大学;2008年
10 张华敏;糖脂灵防治2型糖尿病合并高脂血症的临床研究[D];山东中医药大学;2008年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 张晓薇,邝健全,曾爱群,刘慧姝;脱氢表雄酮诱导多囊卵巢综合征动物模型的研究[J];广州医学院学报;2000年03期
2 冯光荣,尤昭玲,贺冰,罗岚;多囊卵巢综合征动物模型建立的研究现状与展望[J];湖南中医药导报;2004年01期
3 梁晓燕,庄广伦,周灿权,于丛一,郑树森;多囊卵巢综合征中卵巢初级小卵泡bcl-2、bax的表达[J];生殖医学杂志;2001年02期
4 李梅,李志凌,李红发;多囊卵巢综合征卵泡闭锁调节机制的研究进展[J];生殖医学杂志;2004年06期
【相似文献】
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1 倪勤;RNA干扰技术防治病毒性肝炎的研究[J];国外医学.流行病学.传染病学分册;2003年04期
2 李光明,谢青,史毅,李定国,金由辛;siRNA对HSC结缔组织生长因子的抑制作用[J];上海第二医科大学学报;2005年02期
3 燕春艳;RNA干扰技术研究进展[J];实用医药杂志;2003年09期
4 马鹏鹏,葛晔华,郭睿,马静,陈平,薛社普,韩代书;小分子干扰RNA(siRNA)表达载体沉默靶基因的研究[J];解剖学报;2004年06期
5 郭述良,罗永艾;RNA干扰及其在呼吸系统疾病研究中的应用[J];国外医学.内科学分册;2004年12期
6 赵洪波,张嘉宁;RNA干扰技术的应用[J];大连医科大学学报;2003年04期
7 范怡敏,耿飞,吴兴中;RNAi的机制及RNAi技术的应用[J];医学综述;2004年04期
8 王占黎,卢景芬,张亮仁,张礼和;RNA干扰与药物的研究进展[J];国外医学.药学分册;2004年04期
9 熊洁,陈宝安;RNA干扰技术在白血病研究中的应用前景[J];国外医学.肿瘤学分册;2004年11期
10 胡晓霞,李力;RNA干扰技术及在妇科肿瘤研究中的应用[J];国外医学.妇产科学分册;2005年02期
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1 邓清华;刘国文;刘磊;王建国;朱晓岩;李小兵;王哲;;siRNA特异性抑制犊牛原代肝细胞SREBP-1c基因的表达[A];中国畜牧兽医学会家畜内科学分会第七届代表大会暨学术研讨会论文集(上册)[C];2011年
2 季爱民;苏丹;车鸥;李文适;孙靓;张忠义;杨彬;;壳聚糖/siRNA纳米粒介导的功能性基因沉默研究(英文)[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
3 黄伟;吕明;金明姬;杨长青;高钟镐;;mPEG-PCL-g-PEI聚合物的合成及其siRNA递送性能[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
4 陈宇;郑海涛;杨力建;陈少华;沈琦;刘思初;李萡;李扬秋;;靶向抑制PPP2R5C基因的siRNA的筛选[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年
5 刘政;邱广斌;;MYCT-1基因特异的siRNA对GES-1细胞凋亡、增殖及细胞周期的影响[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
6 陈卫华;王跃闽;;Cb1-b特异性siRNA载体的筛选验证[A];华东六省一市泌尿外科学术年会暨2011年浙江省泌尿外科、男科学学术年会论文汇编[C];2011年
7 刘芳蕾;周勇;应可净;;肺癌PLK1基因多态性及siRNA干预的研究[A];2011年第三十三届浙江省呼吸系病学术年会暨呼吸疾病诊治新进展学习班论文汇编[C];2011年
8 薛利军;曹明媚;秦照玲;潘欣;戚中田;;siRNA抑制结核分枝杆菌侵袭相关基因mcela在体外培养的人细胞内的表达[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年
9 章如新;;P物质siRNA在变应性鼻炎中的作用机制研究[A];世界中联耳鼻喉口腔专业委员会换届大会及第三次学术年会暨中华中医药学会耳鼻喉科分会第十七次学术交流会暨广东省中医及中西医结合学会耳鼻喉科学术交流会论文汇编[C];2011年
10 李平;刘苹;陈星云;赵艳;彭艳;陈磊;周元国;;大鼠c-ski基因siRNA真核表达载体的构建及其在成纤维细胞中的干扰效果观察[A];重庆市生物化学与分子生物学学术会议论文摘要汇编[C];2009年
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1 余志平;打开功能基因组学与未来治疗学的大门[N];中国医药报;2004年
2 庄北宁;防治非典,专家称找到基因“新药”[N];新华每日电讯;2005年
3 杨霞;防治SARS药研发获阶段性成果[N];中国医药报;2004年
4 聂翠蓉编译;RNAi:生物技术的蓝月亮[N];科技日报;2003年
5 曾崇君;奇尔根核酸业务试水MBO[N];医药经济报;2004年
6 本报特约撰稿人 陆志城;RNA干扰技术遭遇“缺陷危机”[N];医药经济报;2003年
7 记者 毛黎;美开发出癌症治疗新技术[N];科技日报;2009年
8 张荔子;乳腺癌基因特异性药物曙光初现[N];健康报;2004年
9 杨霞;广东SARS防治药物研究取得阶段成果[N];中国医药报;2004年
10 倪永华;让基因保持沉默[N];科技日报;2005年
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1 胡平方;纤溶酶原激活物抑制剂-1 siRNA治疗实验性肝纤维化[D];第二军医大学;2010年
2 蔡磊;携带Survivin特异性siRNA的完全人源性肝癌单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白对肝癌凋亡的影响研究[D];第四军医大学;2010年
3 张伟;H5N1亚型高致病性禽流感病毒siRNA靶向制剂的研究[D];中国协和医科大学;2010年
4 郭炬;siRNA靶向沉默HPA基因对人膀胱癌BIU-87细胞的生物学及HPA相关基因的影响[D];华中科技大学;2011年
5 徐向上;Aptamer-protamine-siRNA复合物在肿瘤靶向治疗中的作用研究[D];华中科技大学;2010年
6 韩璐;豆科植物蒺藜苜蓿发育相关基因[D];山东大学;2010年
7 王哲文;后发性白内障的发病机制研究[D];吉林大学;2006年
8 向飞宇;心衰的机制与干细胞治疗基础研究[D];复旦大学;2009年
9 张彦萍;纤溶酶原激活物抑制剂-1siRNA抗博来霉素诱导的大鼠肺纤维化作用及机制[D];河北医科大学;2011年
10 万黎;Galectin-3特异性siRNA对肺癌肿瘤干细胞生物学功能影响的研究[D];华中科技大学;2010年
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1 郑亚婷;应用siRNA技术抑制铜绿假单胞菌外膜蛋白OprM表达的研究[D];昆明医学院;2010年
2 贾丽洁;ICP27特异性siRNA抑制HSV-1病毒复制的实验研究[D];郑州大学;2010年
3 付振宇;siRNA沉默HIF-1α基因对人前列腺癌PC3细胞生物学性状的影响[D];苏州大学;2010年
4 韦德芳;利用pSOS-HUS系统筛选靶向乙肝病毒X基因的siRNA的研究[D];重庆医科大学;2010年
5 马婧薇;ASGPR介导的靶向siRNA抑制HBV的复制与表达[D];华中科技大学;2009年
6 方首镕;siRNA干扰MDR1逆转舌癌耐药性表型的实验研究[D];广西医科大学;2011年
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8 王涵;应用siRNA技术下调Survivin抑制鼻咽癌细胞生长的研究[D];昆明医学院;2010年
9 索涛莉;靶向Hsp90β siRNA对Jurkat细胞生长抑制及化疗敏感性影响的研究[D];重庆医科大学;2010年
10 汤容;siRNA抑制人卵巢癌SW626细胞CXCR4基因的研究[D];重庆医科大学;2010年
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