收藏本站
《南京医科大学》 2009年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL的构建、表达、纯化及初步鉴定

朱晓娟  
【摘要】:肝细胞肝癌在我国的发病率较高,且恶性程度高,是严重影响我国人民健康的恶性肿瘤之一。尽管近半个世纪以来我国在肝癌的临床治疗方面积累了丰富的经验,基础研究方面也取得长足的进步,但远未达到控制该肿瘤的程度;肝癌对常规的放疗、化疗方法不敏感,近年来多倾向于以手术为主的综合治疗,但手术治疗仅对部分早期患者适用,且术后一年生存率仅为39.7%,因此亟需利用现代生物技术探索新的治疗方法。 抗体技术及融合蛋白技术在肿瘤治疗方面不断取得进展,但全人抗体与毒素融合蛋白治疗肝癌的研究国内还未见报道;因此,为了探讨全人重组免疫毒素在肝癌的导向治疗中的作用,本研究采用基因工程技术,将全人源c-Met单链抗体基因与绿脓杆菌外毒素PE38KDEL基因重组,构建原核表达载体pBAD/GⅢA/c-Met/PE38KDEL,探索其在大肠杆菌TOP10中的诱导表达情况及表达条件。对诱导产物纯化后,得到抗肝癌免疫毒素c-Met/PE38KDEL,初步确定对人肝癌细胞系SMMC7721的生长抑制作用,从而制备出具有一定临床应用潜能的特异性全人源抗肝癌免疫毒素,为今后肝癌的临床导向治疗研究提供技术贮备。 研究方法 1.以从人源天然Fab抗体库中筛选出的AM2-26克隆作为模板设计引物,扩增出人源抗c-Met单链抗体基因,为便于克隆和表达,在引物两端引进合适的酶切位点和保护性碱基。以质粒pComb3XTT/c-MetFab(AM2-26)为模板,进行聚合酶链反应(PCR),扩增产物纯化后,将其克隆入pMD-18Tvector,挑选阳性克隆测序。 2.用Nco1、EcoR1双酶切pMD-18T/c-Met质粒,将c-Met基因片段与经过同样双酶切的pBAD/GⅢA/PE38KDEL质粒进行黏端连接,连接产物转化E.coliTG1,PCR及Nco1、EcoR1双酶切鉴定pBAD/GⅢA/c-Met/PE38KDEL重组质粒。 3.左旋阿拉伯糖诱导表达蛋白,SDS-PAGE与Westernblot初步鉴定蛋白表达结果。对c-Met/PE38KDEL表达产物进行分离,分别采用SDS-PAGE与Westernblot检测上清与包涵体沉淀中目的蛋白的表达量。8mol/L尿素对c-Met/PE38KDEL包涵体进行变性,HisTrap亲和柱纯化变性液,稀释复性法进行蛋白复性。采用流式细胞术,检测纯化蛋白与人肝癌细胞SMMC-7721的结合活性。 4.采用MTT检测不同浓度的c-Met/PE38KDEL对人肝癌细胞系SMMC-7721的生长抑制作用,并求出半数抑制量IC50。 研究结果 1.PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳显示,用设计的重链、轻链引物,可分别扩增出重链、轻链基因,大小约350bp左右,再通过OverlapPCR可扩增出大小约750bp的c-Met单链抗体基因,与预期大小一致。序列测定结果表明,其序列与已知序列相一致。 2.将测序正确的c-Met单链抗体基因经一系列酶切、连接、转化步骤,获得pBAD/GⅢA/c-Met/PE38KDE表达质粒。重组质粒的酶切及电泳:NcoⅠ、HindⅢ双酶切显示1830bp左右DNA片段,符合c-Met/PE38KDEL基因片段大小,NcoⅠ、EcoⅠ双酶切显示750bpDNA片段,符合c-MetscFv基因片段大小,EcoRⅠ、HindⅢ双酶显示1080bp左右DNA片段,符合PE38KEDL基因片段大小。重组质粒测序结果显示scFv3′端与PE38KDEL5′端碱基连接正确,读码框不变。 3.融合基因经0.02%左旋阿拉伯糖37℃诱导表达4h,获得C-末端带有多聚组氨酸(His)6标签序列的重组融合表达蛋白(70ku)。超声裂菌法分离的结果显示pBAD/GⅢA/c-Met/PE38KDEL的融合表达蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多。融合蛋白经变性、HisTrap柱纯化及复性,流式细胞术结果显示:c-Met/PE38KDEL免疫毒素具有与人肝癌细胞株SMMC-7721(c-Met阳性)特异性结合。 4.流式细胞术结果显示,重组免疫毒素c-Met/PE38KDEL可诱导人肝癌细胞系SMMC-7721凋亡,且存在着剂量-效应关系;MTT结果显示,c-Met/PE38KDEL对SMMC-7721细胞具有较好的杀伤作用,浓度与A540nm值之间具有较明显的相关性,呈剂量-效应关系,IC50为8.32ug/ml。 结结论 1.成功克隆了人源抗c-Met单链抗体基因; 2.正确构建了c-Met/PE38KDEL融合基因并成功表达融合蛋白; 3.重组免疫毒素c-Met/PE38KDEL对人肝癌细胞系SMMC-7721有较好的生长抑制作用。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R735.7

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前8条
1 黄家强;新一代治疗用抗体——改型抗体[J];国外医学(分子生物学分册);1997年02期
2 芮静安;肝癌肝外科的现状和展望[J];现代实用医学;2004年06期
3 张乐鸣;肝癌治疗的现状[J];宁波医学;1994年02期
4 王建立,徐克森,寿楠海;肝癌的基因治疗[J];中国现代普通外科进展;2004年03期
5 张红缨,张今;PCR技术应用的新进展[J];生物化学与生物物理进展;1996年06期
6 盛立军,宋恕平,宋冬;肝癌药物治疗的新探索[J];中国处方药;2004年09期
7 张思维,李连弟,鲁凤珠,牧人,孙秀娣,皇甫小梅,孙杰,周有尚,戴旭东;中国1990~1992年原发性肝癌死亡调查分析[J];中华肿瘤杂志;1999年04期
8 李丽琴,郑晓军,陈乐贵,史瑞雪,林福生;相思子毒素的分子特点及其在临床中的应用前景[J];中国新药杂志;2002年05期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 吴丛梅,黄天华,吴德生,谢庆东,徐小虎;pEgr-P16重组质粒的构建及其在EC9706细胞中的辐射诱导表达[J];癌变.畸变.突变;2003年04期
2 阮烨,王晓云,谢庆东,黄天华;外源DNA转染精子的实验研究[J];癌变.畸变.突变;2004年03期
3 欧阳松应,徐寿水,沈文律,周传香,李春艳,欧阳红生;人PTEN基因表达载体的构建及其在U_(251)细胞中的表达[J];癌变.畸变.突变;2004年04期
4 陈传德,吴中亮,陈家堃;乙酸镍诱导的人支气管上皮细胞系转化细胞基因组不稳定性分析[J];癌变.畸变.突变;2005年01期
5 熊小芳,黄天华,谢庆东,王晓梅,陈桂兰;精子携带的HBV DNA在小鼠早期胚胎中的复制与表达[J];癌变.畸变.突变;2005年03期
6 吕慧贞;张建朋;陈新;刘静;张元湖;;一种改进的鸭梨总RNA提取方法[J];山东农业科学;2007年05期
7 张秀华;王文锋;;微卫星DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染技术的探讨[J];山东农业科学;2009年06期
8 张学民,王金生;碱裂解法提取质粒DNA方法的改进[J];安徽大学学报(自然科学版);2000年04期
9 陈博;孙彩珍;杨德志;孙尚见;;自拟鳖甲消癥汤合金丝地甲胶囊对晚期肝癌患者症状和生存质量的改善作用[J];中医药临床杂志;2011年01期
10 倪大虎,向太和,张盘娣,吴家道,杨剑波,贾士荣,余增亮;应用低能离子束将抗菌肽ShivaA基因导入恢复系明恢63的研究(简报)[J];安徽农业科学;2000年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 黄家强;卜夏;李卓娅;龚非力;;人TNFα分泌型、跨膜型和跨膜稳定型重组体的构建表达及杀瘤效应[A];生命科学与生物技术:中国科协第三届青年学术年会论文集[C];1998年
2 裴世春;;抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备及定量ELISA方法的建立[A];第十届中国科协年会论文集(三)[C];2008年
3 郭昱嵩;王中铎;刘楚吾;陈志明;刘筠;;勒氏笛鲷(Lutjanus russellii)线粒体DNA全序列的测定与分析[A];中国海洋学会2007年学术年会论文集(下册)[C];2007年
4 樊继德;孔庆国;张梅;于喜艳;;子房注射法获得转基因甜瓜植株[A];中国园艺学会第七届青年学术讨论会论文集[C];2006年
5 李俊华;吴少庭;翁亚彪;甘燕;刘洪波;刘茂铃;张仁利;高世同;黄达娜;耿艺介;;弓形虫表面抗原SAG2基因体外扩增、克隆及在Mycobacterium smegmatis mc2155中的表达[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年
6 李俊华;吴少庭;翁亚彪;甘燕;刘洪波;刘茂铃;张仁利;高世同;黄达娜;耿艺介;;弓形虫致密颗粒蛋白GRA4基因体外扩增、克隆及在Mycobacterium smegmatis mc2155中的表达[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年
7 唐小江;马争;黄建勋;黄汉林;李来玉;牛侨;;正己烷引起红细胞膜血影蛋白交联的研究[A];中国环境诱变剂学会抗诱变剂和抗癌剂专业委员会第三次全国学术会议、中国毒理学会生化与分子毒理专业委员会第五届学术交流会、贵州省环境诱变剂学会成立大会暨首届学术交流会论文集[C];2004年
8 严家彬;李新辉;吴淑勤;杜合军;;鳜鱼病毒核酸特异片段表达及高效价抗体制备[A];可持续水产养殖——资源、环境、质量——2003水产科技论坛论文集[C];2003年
9 赵晓瑜;柳伟强;李晓霞;;蚯蚓抗菌肽40kDa Fetidin基因的原核表达与复性[A];2007年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2007年
10 谭盛葵;仇小强;余红平;曾小云;肖增明;胡浪;;广西肝癌高发区原发性肝癌危险因素病因分值及其交互效应[A];中国毒理学会生化与分子毒理专业委员会第六届全国学术会议、中国毒理学会遗传毒理专业委员会第五届全国学术会议、广东省预防医学会卫生毒理专业委员会学术会议、广东省环境诱变剂学会学术会议论文汇编[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 陈仁杰;人源抗鼻咽癌LMP-1胞外区抗体Fab免疫毒素的制备及抗鼻咽癌实验研究[D];南京医科大学;2010年
2 许宁;~(125)I标记抗EGFR全人源Fab及其在肿瘤分子影像中的应用[D];南京医科大学;2009年
3 赵艳萍;兔肝VX2肿瘤影像病理学特征其射频消融后影像病理联系[D];新疆医科大学;2010年
4 梁勇;白念珠菌高铁还原酶基因表达调控及Aft2p转录因子的功能研究[D];南开大学;2010年
5 于双妮;胰腺癌差异表达microRNAs的鉴定及功能研究[D];北京协和医学院;2008年
6 陈其华;前癃通胶囊治疗良性前列腺增生症临床观察及其对间质细胞作用的实验研究[D];湖南中医药大学;2011年
7 马丽菊;云南宣威肺癌细胞系侧群细胞特征分析[D];昆明医学院;2011年
8 许雷;大青杨纤维素合酶基因的克隆与遗传转化的研究[D];东北林业大学;2011年
9 朱伟;摄食抑制因子NUCB2/Nesfatin-1对机体胰岛素敏感性的影响[D];重庆医科大学;2011年
10 付永锋;抗刚地弓形虫特异性人源抗体Fab片段的制备和研究[D];复旦大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 梁斌;一种能同时检测金黄色葡萄球菌A型和B型肠毒素单克隆抗体的制备及特性分析[D];华中农业大学;2010年
2 钱静;携带Apoptin双调控溶瘤腺病毒治疗肝癌的研究[D];浙江理工大学;2010年
3 辛宁;PDX-1真核表达载体构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达[D];郑州大学;2010年
4 陆玉成;AMF基因在食管鳞癌细胞株中的表达及功能初步分析[D];郑州大学;2010年
5 吕文兵;杜氏盐藻异养转化藻株的鉴定及初步功能分析[D];郑州大学;2010年
6 李静;父源性HLA-A基因与子痫前期相关性研究[D];郑州大学;2010年
7 张燕松;肾移植术后患者PBMCs中NF-κB的活性和TNF-α mRNA的表达研究[D];郑州大学;2010年
8 张磊;杜氏盐藻(Dunaliella salina)GPI多克隆抗体的制备及其在MDCK细胞中的定位[D];郑州大学;2010年
9 冯玖玲;杜氏盐藻RbcS基因家族新成员的克隆及功能研究[D];郑州大学;2010年
10 陈操;日本七鳃鳗抗增殖蛋白Prohibitin1研究及类B淋巴细胞免疫调节初探[D];辽宁师范大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 张思维,李连弟,鲁凤珠,牧人,孙秀娣,皇甫小梅,孙杰,周有尚,戴旭东;中国1990~1992年原发性肝癌死亡调查分析[J];中华肿瘤杂志;1999年04期
2 钱军,秦叔逵,何泽明,王琳,陈映霞,邵志坚,刘秀峰;三氧化二砷注射液治疗中晚期原发性肝胆癌的临床研究[J];中华肿瘤杂志;2001年06期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 林媛;祁志荣;孙岚;李明远;蒋忠华;张林;李虹;;大鼠IP-10-PE38KDEL重组免疫毒素原核表达载体的构建及表达[J];免疫学杂志;2008年01期
2 李红;朱晓娟;顾春艳;任勇亚;许静;王忠灿;李玉华;仇镇宁;朱进;冯振卿;管晓虹;;抗日本血吸虫单链抗体免疫毒素的构建 表达及生物学活性鉴定[J];中国血吸虫病防治杂志;2010年02期
3 于芳;金宁一;李昌;刘玉生;佟敬山;胡宁宁;金洪涛;;抗HIV-1 gp120单链抗体和白喉毒素融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达[J];免疫学杂志;2007年05期
4 邱吉;李倩;李小磊;周西坤;黄浓郁;李炯;;抗EGFR单链抗体融合gelonin毒素的原核表达载体的构建及其生物活性研究[J];四川大学学报(医学版);2011年05期
5 王润华,沈倍奋;重组免疫毒素研究概况[J];国际免疫学杂志;1992年01期
6 王子露,朱进,丁贵鹏,孙景军,张建平,冯振卿,管晓虹;全人源抗肝癌重组免疫毒素的制备及其对肝癌细胞的杀伤作用[J];南京医科大学学报(自然科学版);2005年07期
7 刘兵;史俊岩;王舰;王美莲;王斯;郑兰艳;牟玲;罗恩杰;;抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体基因的克隆与鉴定[J];中国病原生物学杂志;2009年05期
8 任永明,张明生,何丹,晁开,罗耀武,黄华樑;相容性溶质支持下重组免疫毒素的周质腔可溶表达及葡萄糖对其表达的影响[J];遗传;2003年01期
9 王贵全,许传杰,杨文,朴春姬,董震;pEgr-sHemopexin重组质粒的构建及体外辐射诱导表达[J];吉林大学学报(医学版);2005年02期
10 李虹,李明远,蒋忠华,吕梅励,张林;IL-18-PE38重组免疫毒素的原核表达及其鉴定[J];四川大学学报(医学版);2004年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 高明华;夏咸柱;薛琳;沈为明;韩启茂;;狂犬病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年
2 刘芳;严懿嘉;朱建国;华修国;高谦;;牛分枝杆菌Mb1761c蛋白的表达及其免疫原性初步研究[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会成立大会暨第一次学术研讨会论文集[C];2008年
3 宫强;刘思国;郭设平;王春来;王勇;刘建东;迟磊;赵昆;孔宪刚;;牛分枝杆菌DNA疫苗免疫效果的研究[A];中国生物工程学会2006年学术年会暨全国生物反应器学术研讨会论文摘要集[C];2006年
4 梅明珠;严亚贤;陆承平;;VT2-B亚单位的重组表达及单克隆抗体的制备[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会成立大会暨第一次学术研讨会论文集[C];2008年
5 王昊鹏;张云;杨静静;王洁;邓小昭;许可;;丙型肝炎双移位F蛋白抑制肝癌细胞p16、p21的表达[A];华东地区第十次流行病学学术会议暨华东地区流行病学学术会议20周年庆典论文汇编[C];2010年
6 陈慧峰;林育纯;张树江;李晓杰;罗洁;林丽娜;李文;胡耀明;陈雯;林忠宁;;PPP2R1A基因启动子区高甲基化对其不同单体型转录功能活性影响[A];全国生化/工业与卫生毒理学学术会议论文集[C];2010年
7 鞠会艳;夏咸柱;高玉伟;杨松涛;李彦舫;;犬瘟热病毒核蛋白基因重组载体的构建与鉴定[A];第十一次全国养犬学术研讨会论文集[C];2005年
8 刘桂林;赵锋;梁志选;;CAV的VP2基因克隆及重组质粒构建的研究[A];全国动物生理生化第九次学术交流会论文摘要汇编[C];2006年
9 杨慧兰;赵举峰;樊建勇;周翠;黄小晏;齐维;;HSV-2潜伏相关转录子ORF2真核表达载体的构建及其在Vero细胞中的表达[A];中华医学会第14次全国皮肤性病学术年会论文汇编[C];2008年
10 周晨妍;王卫杰;曹利军;丰慧根;;乳糖诱导木聚糖酶基因在大肠杆菌中的可溶性表达[A];河南省细胞生物学学会第二届会员代表大会暨学术研讨会论文摘要集[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 耿建扩 蔺玉堂;“表达凝血八因子新的重组质粒”成功研制[N];光明日报;2006年
2 严少慰;查游离DNA 肺癌有望早发现[N];健康报;2008年
3 吴一福;四军医大成功建立HCV多表位基因P815细胞系[N];中国医药报;2006年
4 张中桥;反义Cortactin基因能抑制肝癌细胞转移[N];中国医药报;2006年
5 绍兴县柯桥中学 陶志坚;限制性核酸内切酶相关知识总结[N];学知报;2011年
6 ;抗肝纤维化治疗期待突破[N];中国医药报;2006年
7 王民全;我国畜禽基因工程疫苗技术体系建设进展迅速[N];中国畜牧兽医报;2005年
8 ;HIV抗原基因在番茄内“安家”[N];中国医药报;2004年
9 张中桥;COX-2和VEGF协同促进胃癌生长[N];中国医药报;2005年
10 胡宇芬通讯员 周文燕;科学探索允许失败[N];湖南日报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 吴初新;鱼类PKZ(Protein Kinase Containing Z-DNA Binding Domain)Zα与Z-DNA的结合[D];南昌大学;2010年
2 金海龙;重组免疫毒素CTLA4-ScFv-Mel的构建、制备及活性研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2012年
3 吕梅励;mMIP-1α-DT390重组免疫毒素治疗小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的研究[D];四川大学;2006年
4 陈文捷;DT390-IP10新型重组免疫毒素及其治疗实验性变态反应性脑脊髓炎的研究[D];四川大学;2006年
5 孙国瑛;ALI时肺内TREMs家族表达谱的变化、TREM-2的保护作用及血管活性肠肽的调控[D];中南大学;2012年
6 戴银;鸡MHCⅠ类分子结构与抗病性关系的研究[D];安徽农业大学;2010年
7 常彬霞;细胞色素P450 3A4、谷胱甘肽硫转移酶A1基因转染人肝细胞系的建立及功能测定[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年
8 崔福爱;BMP-6和VEGF表达载体的构建及其促进成骨作用的实验研究[D];山东大学;2010年
9 杜昆;沙眼衣原体CT703蛋白在感染细胞中的表达及功能初探[D];中南大学;2011年
10 刘艳华;小分子重组免疫毒素GnRH-luffinS的制备及其靶向治疗肿瘤的实验研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 朱晓娟;重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL的构建、表达、纯化及初步鉴定[D];南京医科大学;2009年
2 徐伟;重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL对胃癌细胞增殖及凋亡的影响[D];南京医科大学;2011年
3 彭超;重组免疫毒素IL6(T22)PE38基因的构建及原核表达[D];黑龙江八一农垦大学;2010年
4 张战锋;细胞周期依赖性蛋白激酶2重组质粒的构建与表达[D];广州中医药大学;2011年
5 张伟伟;西维因单链抗体基因克隆、表达及活性分析[D];天津科技大学;2010年
6 吴真;BCMA-Fc作为潜在药物的研究[D];天津大学;2012年
7 张亚杰;猪CDK9基因的克隆及其功能初步研究[D];西北农林科技大学;2010年
8 陶勇;弓形虫SAG2基因的克隆、表达及其初步鉴定[D];扬州大学;2010年
9 李茜;pcDNA3.1-preS1-GFP重组质粒的构建及其在小鼠精子内的表达[D];青岛大学;2010年
10 潘晓磊;猪链球菌Ⅱ型MRP基因单价候选疫苗株的研究[D];海南大学;2012年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026