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《南京医科大学》 2010年
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Rbx1蛋白在小鼠卵母细胞中的功能研究

周林  
【摘要】:哺乳动物卵母细胞阻滞在第一次减数分裂前期的双线期。第一次减数分裂的重新启动与成熟过程由多种复杂的机制调控。本实验室应用蛋白质组学技术,成功构建了MII期卵母细胞蛋白表达谱系。在这一谱系的基础上,我们本着寻找和研究与发育相关的重要蛋白质的目的,对鉴定到的蛋白进行分析、查阅文献、功能推测,然后对感兴趣的蛋白进行深入的功能研究。 本研究正是基于以上科研目标,从该谱系中挑选出Rbx1蛋白,作为研究对象。Rbx1,又称Roc1,全名RING box protein-1或regulator of cullins-1。Rbx1蛋白是SCF (Skp1, Cullins, F-box proteins) E3泛素连接酶复合物中的RING成分。SCF通过靶向降解不同的底物蛋白而发挥调节多种细胞生物学过程的作用。然而,Rbx1蛋白在小鼠卵母细胞中的作用目前还没有报道。 本研究着重探讨了Rbx1蛋白在小鼠卵母细胞发育、成熟过程中表达、定位的变化以及相关的生物学功能。首先,我们通过Western blot的方法研究发现Rbx1蛋白在GV期、MI期及MII期的卵母细胞中均存在。免疫荧光结果显示,Rbx1蛋白定位于GV期卵母细胞的胞核和胞浆,随着卵母细胞自发成熟的过程,Rbx1伴随着染色体的浓缩和移动,呈现聚集和动态变化过程。当中期纺锤体形成时,Rbx1蛋白也呈纺锤形态定位,并且与alpha Tubulin共定位。分裂后期,随着同源染色体的分离,Rbx1蛋白伴随染色体分离,一部分进入次级卵母细胞,另一部分进入第一极体。染色体重新浓缩聚集,形成中板排列,进入第二次减数分裂中期,Rbx1蛋白定位重新呈现纺锤体形态。 利用Nocodazole解聚微管结果显示,伴随微管解聚,纺锤体消失,Rbx1蛋白纺锤形定位相应消失,蛋白弥散入胞浆。Rbx1蛋白在卵母细胞成熟过程中定位的动态变化,以及其与Tubulin之间的某种相关性,提示其在卵母细胞成熟过程中可能发挥重要作用。我们利用活细胞工作站,显微注射和RNA干扰技术来研究其生物学功能。 Real Time PCR验证Rbx1卵母细胞胞浆SiRNA显微注射后,表达下降83.33%。活细胞工作站持续观察,结果证实与对照组相比,Rbx1蛋白降低后,第一极体排出率明显下降,对照组第一极体排出率为70.07%,而干涉组仅为53.82%。同时,Rbx1蛋白降低后的第一极体排出速度明显慢于对照组。对照组在10h内第一极体排出率达50%,而干涉组在12h左右时才达到50%排出率。以上结果提示,Rbx1蛋白干涉降低后影响了小鼠卵母细胞第一极体的排出过程。 根据以上实验表型,我们接下来研究Rbx1蛋白影响小鼠卵母细胞成熟过程的机制。以往研究显示Rbx1蛋白影响生长发育,并且这种发育的抑制现象是由与增殖相关的蛋白的聚集引起,即增殖相关蛋白质不能被有效降解,从而影响正常的生长发育。文献提示, Emi1(early mitosis inhibitor 1)为早期有丝分裂原蛋白,其在小鼠卵母细胞细胞成熟过程中发挥作用,并且体细胞中研究证实,Emi1蛋白是SCFβ-trcp E3泛素连接酶的特异性底物。由此可推测,Rbx1蛋白可能通过E3连接酶的作用,影响Emi1蛋白降解而发挥作用。我们利用Western Blot方法验证,Rbx1蛋白降低后,Emi1蛋白表达量是否变化。结果显示,在Rbx1蛋白降低后,Emi1蛋白在MI期发生了聚集。而该蛋白在生理状态下,GVBD后表达量将显著下降,从而提示,Rbx1蛋白降低后抑制和延迟第一极体的排出过程可能是由于Emi1蛋白的聚集导致。 综上,我们研究了Rbx1蛋白在小鼠卵母细胞中的定位表达,在小鼠卵母细胞成熟过程中定位随染色体的移动而动态变化,中期与Tubulin共定位。Rbx1蛋白RNAi后抑制和延迟第一极体的排出,影响了卵母细胞的成熟过程。进一步研究发现这些影响成熟过程可能是由于Emi1蛋白的聚集导致。Rbx1蛋白在小鼠卵母细胞成熟过程中发挥重要作用。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q51

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