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《南京医科大学》 2010年
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下调HDGF基因表达对U87细胞体外生物学行为的影响及机制研究

龙卫国  
【摘要】: 研究目的: 明确肝癌衍生生长因子(Hepatoma-derived growth factor HDGF)与胶质瘤之间的关系。采用RNA干扰(RNA interference RNAi)技术下调HDGF表达水平,研究其对胶质瘤细胞U87体外生物学行为的影响及其可能的分子机制。 研究方法: 1.通过免疫组化实验,研究HDGF在不同级别胶质瘤组织中的表达情况。 2.体外培养胶质瘤细胞,采用Western-blot(WB)和Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)研究5株胶质瘤细胞中HDGF蛋白和mRNA表达水平是否存在差异性,并采用细胞芯片免疫组化一步验证。从5株胶质瘤细胞系中筛选出一株HDGF表达水平最高的细胞株作为下一步实验所需。 3.设计合成HDGF靶向siRNA,以脂质体2000为介质将HDGF-siRNA瞬时转染入U87细胞。同时设立阴性对照组(只用脂质体而不用siRNA)和空白对照组(细胞不做任何处理)。通过PCR和WB观察HDGF表达情况,确定RNAi的效果及最佳干扰时间。 4.通过MTS增殖实验、划痕实验、迁移实验、软琼脂克隆形成实验和侵袭实验研究下调HDGF表达水平对U87细胞生物学行为的影响。 5.利用基因芯片技术检测受HDGF RNAi影响的基因,并通过PCR和WB技术,进一步验证基因芯片结果。 研究结果: 1.胶质瘤组织免疫组化结果显示在不同级别的胶质瘤中,存在HDGF的表达差异。同Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤相比,Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤的HDGF核阳性细胞数明显增多,染色强度明显加深。 2. WB、RT-PCR和细胞芯片免疫组化结果显示在5株胶质瘤细胞中,U87细胞HDGF表达水平最高,U118、U373和SW1873细胞为中等表达,而DBTRG细胞HDGF表达水平最低。 3.通过脂质体瞬时转染siRNA后,U87细胞HDGF表达水平明显下调,以转染48-72h后下调最为显著。 4.三种不同培养条件的MTS结果显示,RNAi下调HDGF后的U87细胞相对于空白和阴性对照组,细胞在体外增殖能力明显减弱(p0.01)。其中无血清条件为显著,增殖抑制率在无血清条件下为18%,在含10%胎牛血清条件下增殖抑制率约为9%,无血清Matrigel预处理组为28%。 5.软琼脂克隆形成实验结果:空白组克隆形成数约为45±5.6个,阴性对照组U87细胞克隆数约为42.5±3.5个, RNAi后U87细胞克隆形成数为7±1.4个(p0.01);迁移实验结果:6h后空白组迁移细胞计数为65.8±3.0,阴性对照组迁移细胞数为59.4±7.4,RNAi组迁移细胞数为23.4±2.9个(p0.01);侵袭实验结果:空白组侵袭细胞计数为22.6±2.8,阴性对照组侵袭细胞计数为16.6±1.8,RNAi组侵袭细胞计数为6.4±1.1个(p0.01)。 6. RNAi后U87细胞相对于空白和阴性对照组,划痕21h后无论迁移的距离或迁移的细胞数均明显短于或少于空白和阴性对照组。 7.基因芯片结果提示下调HDGF后,肝细胞生长因子/分散因子(hepatocyte growth factor/scatter factor,HGF/SF)也显著下调。WB和PCR结果进一步证实转染HDGF siRNA后,U87细胞的HGF/SF表达水平明显下调。 结论: 1.在胶质瘤的组织中存在HDGF表达水平差异,其表达水平与胶质瘤的分级具有相关性。 2.在5株胶质瘤细胞中也同样存在HDGF表达差异,其中以U87细胞表达水平为最高。 3.我们设计合成的siRNA能够特异性的显著下调胶质瘤U87细胞HDGF表达水平。 4.通过RNAi下调HDGF表达水平后,能够显著抑制U87细胞的增殖、迁移、侵袭及非锚着依赖生长。 5. RNAi下调HDGF能使HGF/SF显著下调,提示HDGF可能是通过对HGF/SF的调节作用影响胶质瘤的生物学行为。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R735.7

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