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《南京医科大学》 2010年
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氧化应激对血管内皮细胞中转录因子FoxO1磷酸化的调节作用

王也煜  
【摘要】: 目的: 内皮功能障碍是许多心血管疾病的共同的危险因素。氧化应激引起的细胞损伤是内皮细胞功能障碍的重要机制之一。FoxO(Forkhead box O)是Forkhead转录因子的一个亚家族,它是一类重要的氧化还原敏感的转录因子,参与细胞周期调控、凋亡、氧化应激抵抗等生物学过程。本文采用过氧化氢(H2O2)刺激血管内皮细胞模拟氧化应激模型,探讨H2O2对细胞内转录因子FoxO1的磷酸化调节作用及对其转录活性的影响。 方法: 用贴块法分离培养大鼠主动脉内皮细胞(rat aortic endothelial cells,RAECs),倒置显微镜下观察细胞形态,并用免疫细胞化学法检测内皮细胞表面Ⅷ因子相关抗原和活细胞摄取Dil-Ac-LDL的方法鉴定RAECs纯度。用western blot法检测RAECs和人血管内皮细胞株EA.hy926中FoxO各亚型FoxO1、FoxO3a和FoxO4的表达。亚融合状态的血管内皮细胞经血清饥饿处理24小时后用于实验。为检测不同程度的氧化应激对FoxO1磷酸化的影响,分别以200μmol/L、500μmol/L或1000μmol/L H2O2处理血管内皮细胞20min,收集细胞总蛋白,用western blot法检测FoxO1的S256位点和T24位点的磷酸化水平。选取500μmol/L浓度的H2O2刺激血管内皮细胞20min、30min或60min后,用western blot法检测FoxO1的磷酸化与刺激时间的关系。为明确FoxO1的磷酸化是否与PI3K/Akt信号通路有关,我们检测不同程度和不同作用时间的氧化应激对蛋白激酶Akt磷酸化的影响,同时运用两种特异性的PI3K抑制剂LY294002或wortmannin预先阻断该信号通路,用western blot法观察氧化应激对FoxO1及Akt磷酸化水平的影响。为观察氧化应激引起的磷酸化对FoxO1亚细胞定位的影响,在500μmol/L H2O2刺激RAECs20min后,我们分别提取了细胞浆与细胞核蛋白,用western blot法检测磷酸化FoxO1的分布,并利用免疫细胞化学方法和荧光显微镜观察磷酸化FoxO1的亚细胞定位。为进一步研究氧化应激诱导的FoxO1磷酸化对其转录活性的影响,将RAECs共转染含有FoxO结合序列IRS(insulin-responsive sequence)的荧光素酶报告基因质粒(3×IRS-luc)和FoxO1的表达质粒或对照质粒, 24小时后给予细胞200μmol/L H2O2刺激12小时,裂解细胞,用双荧光素酶报告基因试剂盒测定荧光素酶的活性。最后,我们检测了氧化应激引起的FoxO1磷酸化对其靶基因Bim转录的影响。10μmol/L LY294002预处理RAECs 1h后给予200μmol/L H2O2刺激4h,提取细胞的总RNA,通过Real-time PCR方法检测靶基因Bim的mRNA水平。 结果: 免疫细胞化学和活细胞摄取Dil-Ac-LDL的方法鉴定RAECs纯度为90%以上。RAECs和EA.hy926细胞株内FoxO1及FoxO3a表达丰富。血管内皮细胞在不同浓度H2O2作用20min后,FoxO1的S256位点和T24位点出现磷酸化,其强度呈浓度依赖性;而500μmol/L作用血管内皮细胞后,FoxO1的S256位点和T24位点磷酸化在20min、30min及60min时都能检测到。H2O2刺激对细胞中总FoxO1的含量没有明显影响。Akt的磷酸化呈现与FoxO1相似的浓度和时间依赖性。H2O2诱导的Akt及FoxO1的磷酸化可以被10μmol/L LY294002或500nmmol/L wortmannin预处理所抑制。500μmol/L H2O2作用RAECs20min后,细胞浆组分中磷酸化的FoxO1明显增多,并可以观察到细胞浆中磷酸化FoxO1(T24)荧光的增强。通过报告基因检测发现,FoxO1能明显激活3×IRS-luc报告基因的荧光素酶活性,而H2O2对这一效应有明显的抑制作用。Real-time PCR检测结果显示,Bim mRNA表达水平在磷酸化的影响,同时运用两种特异性的PI3K抑制剂LY294002或wortmannin预先阻断该信号通路,用western blot法观察氧化应激对FoxO1及Akt磷酸化水平的影响。为观察氧化应激引起的磷酸化对FoxO1亚细胞定位的影响,在500μmol/L H2O2刺激RAECs20min后,我们分别提取了细胞浆与细胞核蛋白,用western blot法检测磷酸化FoxO1的分布,并利用免疫细胞化学方法和荧光显微镜观察磷酸化FoxO1的亚细胞定位。为进一步研究氧化应激诱导的FoxO1磷酸化对其转录活性的影响,将RAECs共转染含有FoxO结合序列IRS(insulin-responsive sequence)的荧光素酶报告基因质粒(3×IRS-luc)和FoxO1的表达质粒或对照质粒, 24小时后给予细胞200μmol/L H2O2刺激12小时,裂解细胞,用双荧光素酶报告基因试剂盒测定荧光素酶的活性。最后,我们检测了氧化应激引起的FoxO1磷酸化对其靶基因Bim转录的影响。10μmol/LY294002预处理RAECs 1h后给予200μmol/L H2O2刺激4h,提取细胞的总RNA,通过Real-time PCR方法检测靶基因Bim的mRNA水平。H2O2刺激内皮细胞后显著增高, PI3K抑制剂LY294002预处理则进一步增加了Bim的表达。 结论: 氧化应激引起血管内皮细胞中转录因子FoxO1的S256位点和T24位点磷酸化,其磷酸化水平呈一定的浓度与时间依赖性。上述位点的磷酸化是通过PI3K/Akt信号通路介导的。磷酸化导致FoxO1从细胞核转移至细胞浆,并对其转录活性有负性调控作用。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R363

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