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《南京医科大学》 2010年
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LPS对羧酸酯酶1和2(CES1、CES2)表达的研究

李杨  
【摘要】: 羧酸酯酶(Carboxylesterases,CES)属于由多基因调控的α/β折叠蛋白水解酶超家族,属I相药物代谢酶,广泛分布于各种组织中。其中,肝脏表达CES1和CES2两种羧酸酯酶以CES1为主,肠道则主要表达CES2。羧酸酯酶在水解代谢多种药物(包括前体药物)的过程中发挥重要作用。已有研究表明,炎症和感染等病理状态下,肝脏中多种药物代谢酶的表达水平降低,活性下降,造成药物清除率下降,进而引起血浆药物浓度增高发生药物毒性反应。 细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性菌细胞壁的主要组成成分,广泛存在于人和动物的消化道中。LPS被广泛用来建立动物败血症模型研究炎症和感染对药物代谢酶表达及活性的影响。 本文首先从整体水平研究了LPS造成的炎症状态对小鼠肝脏、肠道组织CES1和CES2表达水平及活性的影响;接着在细胞水平研究了LPS对人肝癌细胞株HepG2 HCE1和HCE2表达的影响,最后研究了HCE1和HCE2表达变化对其底物药物氯吡格雷和伊立替康作用及毒性反应带来的影响。 上述实验结果表明,炎症状态能够下调小鼠肝脏、肠道组织羧酸酯酶的表达及活性。LPS预处理人肝癌细胞株HepG2后改变药物的作用及毒性反应,说明炎症状态可显著影响药物的疗效。本研究结果为指导临床合理用药提供了理论依据。合理的药物剂量,既可以提高疗效,避免用药过量,又可以节约资源,产生社会和经济效益。 第一部分LPS对小鼠肝脏、肠道组织羧酸酯酶1和2表达影响的研究 为了研究炎症状态对CES1和CES2表达及活性的影响,我们用LPS建立小鼠炎症状态模型。取小鼠肝脏、肠道组织用qRT-PCR技术检测CES1和CES2 mRNA的表达。结果显示LPS处理组小鼠肝脏CES1和CES2的mRNA表达分别比对照组降低了96%和92%,差异均有统计学意义(P 0.05);LPS处理组小鼠肠道CES1和CES2的mRNA的表达分别比生理盐水组下降75%和87%,差异均有统计学意义(P 0.05)。接着我们用Western Blotting方法检测小鼠肝脏、肠道组织CES1和CES2的蛋白表达变化。实验结果显示LPS处理后小鼠肝脏CES1和CES2的蛋白表达水平分别比对照组降低62%和58%,肠道组织CES1和CES2的蛋白表达水平分别比对照组降低35%和42%,差异均有统计学意义(P 0.05)。最后我们检测小鼠肝脏、肠道组织CES1和CES2的表达降低是否影响羧酸酯酶的水解活性。取小鼠肝脏、肠道组织蛋白样品,通过水解通用底物硝基苯基乙酸酯(PNPA)来检测羧酸酯酶的总活性。与小鼠肝脏、肠道组织CES1和CES2表达水平降低趋势一致,炎症状态下小鼠肝脏羧酸酯酶的总活性值为1.572±0.319 nmol/mg/min,明显低于对照组值3.269±0.228 nmol/mg/min (P 0.05)。LPS处理组小鼠肠道羧酸酯酶的总活性值为0.413±0.082 nmol/mg/min,也显著低于生理盐水组值0.885±0.102 nmol/mg/min(P 0.05)。上述研究结果表明,炎症状态降低小鼠肝脏、肠道组织CES1和CES2的表达水平,影响其功能即降低羧酸酯酶的总水解活性。 第二部分LPS对人肝癌细胞株HepG2羧酸酯酶1和2表达的影响及对其底物药物作用的研究 通过第一部分的研究,我们发现LPS能够降低小鼠肝脏、肠道组织CES1和CES2的表达水平,影响其功能即降低羧酸酯酶的水解活性。那么CES1和CES2表达及活性的降低是否会给临床用药带来影响?接下来我们以人肝癌细胞株HepG2为研究对象,在细胞水平研究LPS对HCE1和HCE2蛋白表达的影响。Western blotting结果显示,LPS处理人肝癌细胞株HepG2后可显著降低其HCE1和HCE2的蛋白表达水平。此外,为观察人肝癌细胞株HepG2经LPS处理后对相应底物药物氯吡格雷和伊立替康的水解能力是否发生变化?我们用分光光度计检测了细胞蛋白样品水解硝基苯基乙酸酯(PNPA)的能力,结果显示,蛋白样品总的水解活性明显降低。文献报道,HCE1水解抗凝药氯吡格雷后可降低其毒性反应,因为原形药物比其代谢产物更具毒性;相反,抗肿瘤药伊立替康经HCE2水解后的代谢产物毒性比其原形药物大。因此,我们推测,用LPS预处理细胞会增加氯吡格雷的细胞毒性,降低伊立替康的细胞毒性。为观察LPS降低HCE1和HCE2的蛋白表达水平是否改变其底物药物的作用和毒性反应,我们用不同浓度的抗凝药氯吡格雷和抗肿瘤药伊立替康处理HepG2细胞48h,用MTT法测定细胞活力并拍照观察细胞形态学的变化。实验结果显示,LPS预处理组与无LPS预处理组的细胞活力有明显差异:抗凝药氯吡格雷对LPS预处理细胞的毒性作用大于未用LPS预处理的细胞;相反,抗肿瘤药伊立替康对LPS预处理细胞的毒性作用小于未用LPS预处理的细胞,形态学实验结果表明,用氯吡格雷作后处理,LPS预处理的细胞形态发生明显的变化,如皱缩、聚集等,而无LPS预处理的细胞形态则接近正常。用伊立替康作后处理的细胞实验结果与氯吡格雷相反。细胞后续处理的形态学变化结果与细胞活力实验结果一致。 通过LPS对CES1和CES2表达及活性影响的研究,证明了炎症状态可下调药物代谢酶的表达及活性。通过MTT和形态学实验证明了炎症状态下调羧酸酯酶的表达可改变其底物药物的作用和毒性反应。本研究结果为指导临床合理用药提供了实验依据。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R96

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