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《南京医科大学》 2010年
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体外吉西他滨筛选富集人胰腺癌细胞株SW1990肿瘤干细胞的研究

安勇  
【摘要】: 目的建立吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株SW1990/GZ,并在肿瘤干细胞理论水平探讨胰腺癌获得性耐药的机制。方法在SW1990细胞的培养液中添加IC50浓度(3μM)的吉西他滨,待细胞适应后逐渐增加吉西他滨的剂量,即以间歇浓度梯度倍增法建立吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株SW1990/GZ,建成后SW1990/GZ的IC50为232.2μM;倒置显微镜下观察细胞形态学表现;MTT法分别测定耐药株细胞和亲代细胞的增殖能力,计算耐药指数(RI);细胞计数绘制细胞群体倍增时间;流式细胞仪检测细胞周期。分别提取亲代细胞株SW1990和耐药细胞株SW1990/GZ细胞的细胞总RNA,荧光定量PCR检测基因ABCB1 (MDR1), ABCC1(MRP)及ABCG2(BCRP)的表达;Western blot检测蛋白ABCB1, ABCC1和ABCG2的表达,β-actin作为内参照。将不同浓度的耐药细胞株SW1990/GZ细胞和亲代SW1990细胞接种到裸鼠皮下,每天观察成瘤的体积,16周后处死老鼠取瘤送检病理;利用流式细胞仪技术,分别通过SP(side population,边缘细胞)法和表面特异抗原标记法(CD44~+CD24~+)检测肿瘤干细胞含量。结果在吉西他滨作用后,细胞会表现出形态学上的改变,细胞体积变大,伸出足突,类似神经细胞样改变。待适应该剂量吉西他滨后,细胞体积缩小,足突消失。计算耐药株SW1990/GZ的耐药指数为77.2;流式细胞仪细胞周期检测发现,耐药株SW1990/GZ细胞更多地处于G0/G1期,S期细胞比例少于SW1990细胞(P0.05)。实时荧光定量PCR检测耐药株SW1990/GZ和亲代SW1990中ABCB1, ABCC1及ABCG2基因的表达,发现三者在耐药株中的表达明显高于亲代细胞株(P 0.01)。裸鼠皮下接种1×10~5个SW1990/GZ细胞,3周后可观察到明显的新生肿瘤块,而植入1×10~5个SW1990细胞,至16周也未形成明显种植瘤。流式细胞仪对两株细胞进行SP分析,结果显示耐药株SW1990/GZ中SP细胞比例为(11.03±0.98)%,相比亲代SW1990中(4.56±0.87)%有明显增高(P 0.01)。流式细胞仪检测CD_(44)~+CD_(24)~+细胞在两者中的含量分别为SW1990/GZ(8.73±0.81)%和SW1990(1.13±0.35 )%(P 0.01),其中CD_(44)~+细胞比例从(41.9±3.4)%提高到(90.3±5.7)%。结论通过梯度浓度倍增法用吉西他滨可以使胰腺癌细胞株SW1990获得性耐药能力提高,CD_(44)与胰腺癌获得性耐药关系密切。耐药株SW1990/GZ中SP细胞和CD_(44)~+CD_(24)~+细胞比例增高,体外吉西他滨可以筛选富集胰腺癌肿瘤干细胞。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R735.9

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