靶向大鼠血管平滑肌细胞STAT3的慢病毒干扰载体的构建及其效果鉴定的研究

段超

【摘要】：目的探讨大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养方法,了解其生长特性,为血管增生性疾病的治疗研究提供试验材料。同时针对信号传导子及转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)基因的不同部位,构建靶向STAT3基因的慢病毒干扰载体,鉴定并筛选出最佳抑制效率的干扰载体。方法采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,用倒置相差显微镜观察其生长情况,以免疫细胞化学染色做鉴定,台盼蓝染色进行活力检测。针对STAT3基因的不同部位设计4对短发卡RNA(short hairpin RNA, shRNA)的寡核苷酸片段,克隆到慢病毒干扰载体PLKO.1中,构建靶向STAT3基因的shRNA慢病毒干扰载体PLKO.1-STAT3-shRNA-1、2、3、4。利用脂质体将其与包装外壳蛋白质粒(pVSV-g)和包膜质粒(Pax-2)共转染293T细胞,荧光显微镜观察293T细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)表达。收集培养上清过滤后即获得病毒悬液,梯度稀释法测定病毒滴度,以一定感染复数(multiplicity of infection, MOI)的病毒量感染靶细胞大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,Western blot法检测并筛选最佳抑制效率的shRNA干扰载体。结果85%的大鼠胸主动脉组织块接种存活,原代培养后14d左右即可传代,至少可以传8代以上,并且细胞形态、生长特点不发生明显的改变,6代的血管平滑肌细胞纯度达97%以上。台盼蓝染色约有98%的细胞为活细胞。镜下培养的血管平滑肌细胞呈典型的“谷峰状”生长,免疫组化染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达。4个靶向STAT3基因的shRNA慢病毒干扰载体PLKO.1-STAT3-shRNA-1、2、3、4经限制性酶切和测序确实基因插入正确, Western blot法证实PLKO.1-STAT3-shRNA-1、2、3、4均能抑制细胞内STAT3基因的表达,其中以PLKO.1-STAT3-S1最为明显。用PLKO.1-STAT3-S1转染血管平滑肌细胞后可以促进细胞凋亡。结论正确地利用组织贴块法可以简单、经济、高效地培养出大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,为血管增生性疾病的治疗研究提供了理想的细胞模型。成功构建了靶向STAT3基因的shRNA慢病毒干扰载体PLKO.1-STAT3-shRNA-1、2、3、4,并筛选出最佳抑制效率的干扰载体PLKO.1-STAT3-S1,为进一步研究JAK/STAT(janus kinase/ signal transducer and activator of transcription)信号通路参与调控血管再狭窄过程中细胞增殖迁移的分子机制及为血管桥再狭窄的分子靶向治疗奠定了基础。

【关键词】：血管平滑肌细胞 原代培养 shRNA 慢病毒 STAT3
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R543
【目录】：

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