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《南京医科大学》 2011年
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地塞米松对嘌呤霉素模型人足细胞损伤的保护机制研究

李婷  
【摘要】:肾小球足细胞及其足突间的裂孔隔膜是构成肾小球滤过屏障的重要组成部分,而多个位于足细胞和裂孔隔膜的相关分子如nephrin,podocin,CD2AP和α-actinin-4等,在蛋白尿的发生发展过程中起重要作用。人肾小球足细胞系的建立为我们从细胞分子水平研究蛋白尿的发生机制带来可能。要进一步从细胞水平研究足细胞和裂孔隔膜关键分子的生物学作用,建立足细胞损伤的细胞模型为一比较好的方法。目前,利用体外培养足细胞,特别是人足细胞研究糖皮质激素作用机制的报道较少,而且文献报道中应用嘌呤霉素的浓度和时间差别很大。本研究旨在建立嘌呤霉素人足细胞损伤的体外模型,为进一步研究蛋白尿发生的分子机制提供条件。我们既往的研究表明地塞米松能够直接作用于足细胞,也有研究示其抑制足细胞凋亡和增加足细胞骨架F-actin的稳定性,但是其对足细胞作用的具体分子机制目前尚未完全阐明。所以我们进一步用体外培养的人肾小球足细胞,探讨地塞米松的抗蛋白尿的具体分子机制。 【目的】 1.建立嘌呤霉素致人足细胞损伤的体外模型,为进一步研究足细胞相关分子在蛋白尿发生、发展中的分子机制提供条件。 2.观察地塞米松预处理对嘌呤霉素损伤所致的足细胞活力和足细胞凋亡情况的影响。 3.探讨地塞米松的抗蛋白尿机制与裂孔隔膜关键分子nephrin的关系。 【方法】 1.足细胞的培养与传代:细胞生长在含胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠(ITS,胰岛素5μg/ml、转铁蛋白5μg/ml和亚硒酸钠5ng/ml)、10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100mg/L链霉素的RPMI 1640培养液中,在5%CO?、33℃培养孵箱传代培养。然后转入37℃、5%CO_2培养孵箱分化培养至少10d后进行实验。分化成熟的足细胞以无血清RPMI1640培养基同步化处理12h用于实验。 2. MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑,简称噻唑蓝)法检测足细胞活力,其分组为:①正常对照组;②嘌呤霉素(PAN 0.5μg/ml)组;③PAN(4.5μg/ml)组;④P AN(1.5μg/ml)+ DEX(1×10-7~1×10-5 M)组;以上4组分别培养12、24、48、72h。 3. DAPI染色检测细胞凋亡:实验分组同MTT,因12小时后MTT法检测各浓度组的嘌呤霉素损伤和地塞米松保护作用均不明显,在本组实验中剔除12h检测的各组。 4. Western印迹检测足细胞nephrin的表达:在前期实验中,通过对嘌呤霉素干预足细胞后细胞活力和凋亡情况的检测,发现嘌呤霉素(PAN) 0.5μg/ml组对足细胞损伤不明显,而较大的计量组(PAN 1.5μg/ml)在干预12h后足细胞即有大批死亡,因此将分化成熟的细胞分为以下3组:①正常对照组;②PAN (1.5μg/ml)组: PAN分别培养足细胞24、48、72h;③PAN (1.5μg/ml) +地塞米松(DEX)1×10-7~1×10-5 M)组;嘌呤霉素分别与不同浓度DEX共同培养足细胞48h。用Western印迹分别检测以上3组足细胞nephrin的表达。 【结果】 1.嘌呤霉素作用后足细胞活力的测定4.5μg/ml嘌呤霉素作用12h后足细胞活力明显降低。24小时后,与正常对照组(1.02±0.08)相比,PAN 1.5μg/ml组(0.95±0.04)足细胞活力明显降低(p0.01)。直到72小时后,PAN 0.5μg/ml组(0.75±0.03)较正常对照组(1.05±0.11)足细胞活力才有明显降低(p0.01)。 2.嘌呤霉素作用后足细胞凋亡比例的变化4.5μg/ml嘌呤霉素作用12h后足细胞凋亡比例明显增加。与正常对照组(3.41%±1.28%)相比,嘌呤霉素作用48小时后,1.5μg/ml组(21.61%±3.98%)足细胞凋亡比例明显增加(p0.01)。72小时后,PAN 4.5μg/ml组几乎见不到正常足细胞,而PAN 0.5μg/ml组足细胞凋亡比例虽有增加,和正常对照组相比差异没有统计学意义。 3.嘌呤霉素作用后裂孔隔膜蛋白nephrin表达的变化(Western Blot)与正常对照组相比,嘌呤霉素处理足细胞24小时后,nephrin的表达开始下降,48h和72h后,nephrin的表达明显下降。 4.地塞米松预处理足细胞后足细胞活力的测定在PAN处理足细胞前,用DEX预处理足细胞30分钟。48小时后,地塞米松预处理的嘌呤霉素损伤组足细胞活力分别为: DEX 1×10-5M(0.96±0.06), DEX 1×10-6M(0.86±0.05), DEX 1×10-7M(0.78±0.03),和正常对照组(1.06±0.09)及PAN 1.5μg/ml组(0.34±0.05)相比,以及三组内部相比差异均有统计学意义,其中DEX 1×10-6 M和DEX 1×10-7M组之间(p0.05),其余(p0.01)。72小时后,差异更显著。 5.地塞米松预处理对足细胞凋亡的保护作用48h后,和PAN 1.5μg/ml组(20.60%±5.49%)相比,DEX 1×10-5M组(12.10%±2.71%)细胞凋亡比例显著下降(p0.05),72h后,另外两组用DEX预处理实验组和单独嘌呤霉素处理组相比,细胞凋亡的比例也有下降,差异有统计学意义。 6.地塞米松预处理组nephrin表达的变化(Western Blot)经过DEX预处理,nephrin的表达明显上调,其中以DEX 1×10-6 M组作用最强,随着DEX浓度的降低,DEX的作用减弱。 【结论】 1.嘌呤霉素对足细胞的损伤呈时间和剂量依赖性,构建嘌呤霉素人足细胞损伤模型的合适浓度嘌呤霉素浓度为1.5μg/ml,作用时间为48h。 2. DEX可以直接作用于足细胞,增加nephrin的表达量,该作用可能与其保护足细胞及改善蛋白尿有关。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R96

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