蚊抗药性检测靶标基因的筛选、鉴定及现场初步应用

【摘要】：蚊媒病是全世界最重要的人类传染病之一，包括疟疾、登革热等，严重危害人类的健康。化学防制是控制蚊媒病传播的一个重要手段。实践证明，杀虫剂对于控制蚊媒病的传播非常有效。然而随着杀虫剂的长期、大量使用，蚊媒的抗药性也随之发生和发展。至今抗药性已成为当前控制蚊媒病的最大障碍。蚊媒抗药性治理的前提在于早期发现抗药性和监测抗药性的发展。所以，发现并研究新的抗药性靶标基因，建立蚊媒抗药性现场检测方法一直是蚊媒病防治研究的重点课题。 本研究选取在我国分布广泛的淡色库蚊为研究对象，首先构建了包含细胞色素P450家族、GST家族等25个杀虫剂抗性相关基因的基因芯片，检测实验室种群及现场种群中上述基因的表达情况；然后运用实时定量PCR技术对基因芯片结果进行验证，从中筛选并初步鉴定出可作为抗药性检测的候选靶标基因；进而在多个现场种群对候选靶标基因进行进一步验证，鉴定出现场抗药性检测靶标基因，以期为建立蚊杀虫剂抗性的现场检测和动态监测方法奠定基础，并有望为深入阐明蚊抗药性的分子机理提供科学依据。 本研究的主要结果如下： 1通过WHO幼虫浸渍法建立了淡色库蚊实验室种群的敏感品系与抗性品系；通过WHO成蚊接触筒法建立了淡色库蚊南京现场种群的敏感品系与抗性品系。 2成功构建了淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关基因的表达谱芯片。经RNA的质量控制的结果显示：待测样本的总RNA含量6μg，OD260/OD280≧1.8、OD260/OD230≧1.6；荧光标定效率均大于10，最高为25.2；数据间相关性分析显示各个样本进行生物学重复检测及技术性重复检测时，相关系数r值介于0.951-1.000间，这些结果说明：芯片杂交质量合格，待测样本的数据的可信度高、重复性强。 3基因芯片检测了25个杀虫剂抗性相关的基因在不同种群中（实验室种群及南京现场种群）抗性品系与敏感品系的表达差异。 基因芯片中点制的8个已报告的与杀虫剂抗性相关的P450家族成员，经统计学分析，发现各个基因间的表达趋势在实验室品系及现场品系间并不一致。结果提示，在蚊代谢抗性形成过程中，P450家族各成员发挥的作用各不相同。 在本研究中，GSTT2在南京现场种群抗性品系中高表达2.75倍；而实验室种群抗性品系较敏感品系高表达1.28倍，未达到实验设定的1.5倍差异表达阈值。由此推测，GST与有机磷杀虫剂抗性密切相关，而在拟除虫菊酯杀虫剂抗性中可能不发挥作用或不发挥主要作用。 南京现场种群中表达上调的基因较实验室种群明显为多。可能的原因一是实验室种群和现场种群以及各现场种群间生活的不同环境，其影响了相关抗性基因的表达，尤其是一些代谢酶类基因；其二，现场种群抗性品系经由WHO成蚊接触筒法定性检测，各品系间抗性水平可能差别较大，表现为不同的量效关系。这些基因虽然已被实验确认为昆虫抗药性基因，但其似不适合作为蚊现场种群抗性的检测靶标基因，有待进一步研究。 综合以上分析，初步鉴定出11个候选基因做为抗药性检测的候选靶标基因。这11个基因包括：糜蛋白酶2（chymotrypsin-2）、细胞色素P4506A1（cytochromeP4506A1,CYP6A1）、细胞色素P4506Z10（cytochrome P4506Z10,CYP6Z10）、谷胱甘肽S转移酶T2（Glutathione S-transferaseT2，GSTT2）、乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase,LDH）、肌球蛋白轻链2（myosin light chain2，MLC-2）、视蛋白-1（opsin-1）、蛋白酶体β亚单位6（proteasome subunit beta type6，PSMB6）、核糖体蛋白磷酸化酶（ribose-phosphate pyrophosphokinase， RPP）、核糖体蛋白S29（ribosomal protein s29，RPS29）9和胰蛋白酶-2（trypsin-2）。 4在南京现场种群中，用定量PCR技术对11个候选基因的表达进行验证，结果显示：CYP6Z10和PSMB6的表达趋势相一致。 在实验室种群或现场种群，CYP6Z10均在抗性品系高表达，分别为敏感品系的3.60倍（p0.05）和5.60倍（p0.05），定量PCR验证结果发现其在南京现场种群中的抗性品系高表达2.56倍(p0.01)。结果提示，CYP6Z10参与了蚊对拟除虫菊酯杀虫剂的代谢作用。Komagata等在致倦库蚊的研究中还发现，CYP6Z10的表达不依赖发育阶段的变化而变化，其在蚊卵、三龄幼虫的第1、2、3天、四龄幼虫的第1天和第3天及雌性与雄性成蚊间的表达水平均无显著性差异。本实验选取的淡色库蚊均为羽化后3天的雌性成蚊。以上结果提示，CYP6Z10有望作为蚊成虫或幼虫现场种群抗药性检测的靶标基因，值得进一步研究。 在实验室种群或现场种群，PSMB6均在抗性品系高表达，分别为敏感品系的8.40倍（p0.05）和2.26倍（p0.05）。定量PCR验证结果发现其在南京现场种群中的抗性品系高表达3.57倍(p0.05)。本实验室前期研究发现PSMB6在抗性蚊细胞中高表达，为敏感蚊细胞的2.50倍（p0.05）。进一步采用实时荧光定量PCR研究发现，PSMB6在抗性蚊幼虫中高表达，是敏感蚊幼虫的1.41倍（p0.05）。结果表明，在蚊细胞、幼虫及成蚊的抗性品系中，PSMB6在mRNA水平均高表达，而且在蛋白水平也具有表达差异，进一步证明PSMB6与蚊对杀虫剂抗性密切相关，其有望作为现场种群抗药性检测的靶标基因。 双变量相关性分析的结果显示：CYP6Z10和PSMB6均与抗性表型有强相关性，相关系数分别为0.933（p0.01）和0.787（p0.01）。 综合以上结果，鉴定CYP6Z10和PSMB6为现场抗药性检测的靶标基因。 5通过WHO接触筒法建立了山东6地区现场种群的敏感品系与抗性品系。在山东现场种群检测中，单独应用CYP6Z10，只有在滨城及平阴地区的检出率为100%，其余地区的检出率为66.7%-83.3%，平均检出率为86.1%（155/180）；单独应用PSMB6做为检测靶标基因，其在东平、孤岛及惠民地区的检出率为100%，其余地区为83.3%，平均检出率可达92.0%（165/180）；而联合使用该2个基因做为抗药性检测靶标基因，可以在以上任何一地，达到100%检出率。由此我们建议，如果仅使用1个靶标基因现场检测抗性，似应选择平均检出率较高（92.0%）的PSMB6；在条件允许的情况下，似应选择同时使用该2个靶标基因，以免发生漏检。无疑，PSMB6和CYP6Z10的同步检测方法值得进一步研究。 本研究结果为建立蚊拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的现场检测和动态监测方法奠定基础，并有望为深入阐明蚊抗药性的分子机理提供科学依据。