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《南京医科大学》 2015年
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CARD6对心肌肥厚发生发展的作用及其机制研究

李良鹏  
【摘要】:研究背景心肌肥厚是一种复杂的并且合并众多因素参与调节的动态过程,同时也是高血压病、瓣膜病、心肌病、心肌梗死等大多心血管疾病共同经历的病理过程。心肌肥厚是对血流动力学负荷、血管紧张素、生长因子以及激素等多种心血管刺激因素所做出的适应性代偿反应,它能够使心室壁压力降低,维持甚至可以提高心脏排血量,然而长期的应激将会导致持续性病理性心肌肥大,并伴随有心脏形态和功能上的恶化,表现出炎症、纤维化及异常基因表达等变化,最终会导致心肌缺血、恶性心律失常、心力衰竭甚至猝死。因此,发现介导心肌肥厚的特异性分子及信号通路,对于进一步阐明心肌肥厚的发生发展机制,从细胞分子水平上调控心肌肥厚的病理生理进程,为防治心力衰竭提供新的靶点和新的治疗策略,具有非常重要的理论和临床意义。胱天蛋白酶募集域蛋白6(caspase recruitment domain protein 6,CARD6)作为CARDs家族的重要成员之一,它与蛋白激酶RIP家族成员形成复合体,作为NOD样受体(Nod-like receptors,NLRs)及TLR样受体(Toll-like receptors,TLRs)通路的重要媒介物,激活NF-κB等信号通路,在机体先天性及后天性免疫反应和炎症应答等方面起重要调控作用。Northern分析表明,CARD6广泛存在于哺乳动物的器官组织中,包括心脏和骨骼肌组织中。然而对CARD6的功能研究,包括在心血管疾病中的研究,尤其在心肌肥厚中,目前国内外尚未见报道。因此,本课题主要通过建立小鼠心肌肥厚模型,观察CARD6在心肌肥厚中的表达变化,运用心脏特异性CARD6基因敲除及转基因小鼠,以探讨CARD6在心肌肥厚发生发展中的作用,并进一步阐明其可能的分子机制。研究方法第一部分:选取体重24~26g、10~12周龄的雄性C57BL/6为背景的野生型(wild type,WT)小鼠为实验对象,应用主动脉缩窄(aortic banding,AB)方法制备压力性负荷诱导的心肌肥厚动物模型。将小鼠随机分为4组:假手术组(sham)、模型组(ab)术后2周、4周和8周。首先应用real-timepcr对心肌细胞肥大标志物(anp、bnp、β-mhc)的mrna表达水平进行检测,同时采用real-timepcr、westernblot检测ab手术后不同时间点心肌组织中card6mrna和蛋白表达水平。第二部分:选取体重在24-26g、10-12周龄的雄性c57bl/6为背景的card6-flox对照组小鼠、心脏特异性card6基因敲除小鼠(ccard6-ko)为实验对象,建立压力性负荷诱导的小鼠心肌肥厚模型,card6-flox和ccard6-ko小鼠分别随机分为假手术组(sham)和模型组(ab),并且在术后4周检测相关指标。首先用超声心动图评价小鼠心脏结构和心脏功能;取材观察小鼠心脏大体形态,并计算心脏重量与体重(hw/bw)的比值、肺脏重量与体重(lw/bw)的比值及心脏重量与胫骨长度(hw/tl)的比值;病理学检测行he及wga染色观察心肌细胞横截面积,psr染色观察心肌间质及周围血管胶原纤维含量;通过real-timepcr检测心肌肥厚标志物(anp、bnp、β-mhc)以及心肌纤维化标志物(collageniα、collageniii、ctgf)的mrna表达水平。第三部分:应用转基因技术,构建心脏特异card6转基因(tg)小鼠。选取体重在24-26g、10-12周龄的雄性c57bl/6为背景的非转基因小鼠(ntg)及心脏特异性card6转基因小鼠(tg)建立小鼠心肌肥厚模型,随机分为sham组和ab组。在ab术后4周,超声心动图评价小鼠心脏结构和功能;取材观察心脏大体形态,并计算hw/bw、lw/bw及hw/tl的比值;he及wga染色观察心肌细胞横截面积,psr染色观察心肌间质及周围血管胶原纤维含量;real-timepcr检测心肌肥厚标志物(anp、bnp、β-mhc)以及心肌纤维化标志物(collageniα、collageniii、ctgf)的mrna表达水平。第四部分:以重组腺病毒载体adshcard6和adcard6感染培养的原代大鼠心肌细胞,分别以adshrna和adgfp作为对照,再分别予以pbs、血管紧张素ii(angii,1μmol/l)加入刺激48小时后,使用免疫荧光(抗肌球蛋白重链的单克隆抗体,α-actinin)染色法对心肌细胞肥大程度进行评价,并应用real-timepcr方法对心肌细胞肥大标志物(anp、β-mhc)的mrna表达水平进行检测。第五部分:应用westernblot方法进一步分别检测各组小鼠心肌组织中心肌肥厚相关信号通路的蛋白表达情况。研究结果第一部分:在c57bl/6小鼠心肌肥厚模型中,心力衰竭指标anp,bnp及β-mhc的mrna水平逐渐升高,同时real-timepcr和westernblot结果显示,与假手术组(sham)相比,ab术后2周小鼠的心脏组织card6的mrna和蛋白水平均开始逐渐升高,在4周时达到最高峰,至8周时开始降低。第二部分:在card6-flox和ccard6-ko小鼠心肌肥厚模型中,超声动图检测显示,ccard6-ko小鼠反映心肌肥厚的指标左室舒张末内径(lvedd)、左室收缩末内径(lvesd)均大于card6-flox小鼠,同时心功能的指标短轴收缩率(fs%)降低的程度明显大于card6-flox小鼠;取材发现,ccard6-ko小鼠的hw/bw、lw/bw及hw/tl的比值均高于card6-flox小鼠;he、wga和psr染色显示ccard6-ko小鼠心肌细胞面积和纤维化程度较card6-flox小鼠明显增加,且real-timepcr结果显示ccard6-ko小鼠心肌组织中anp、bnp、β-mhc和collageniα、collageniii、ctgf的mrna表达水平均较card6-flox小鼠升高。第三部分:我们利用显微注射技术成功构建了以c57bl/6为背景的心脏特异性card6转基因小鼠。在ntg和tg小鼠心肌肥厚模型中,与基因敲除组明显不同的是,转基因小鼠则表现出相反的结果。超声结果显示,与ntg组小鼠相比,tg组小鼠反映心肌肥厚(lvedd、lvesd)和心功能(fs%)的指标得到显著改善。取材结果显示,与ntg组相比,tg组hw/bw、lw/bw及hw/tl的比值明显降低;he、wga和psr染色发现,与ntg组小鼠相比,TG组小鼠心肌细胞面积和纤维化程度明显减少,且TG组小鼠心肌组织中ANP、BNP、β-MHC和Collagen Iα、Collagen III、CTGF的mRNA表达水平均显著降低。第四部分:体外研究结果显示,在Ang II(1μmol/L)刺激48小时后,腺病毒AdshCARD6感染原代大鼠心肌细胞后,培养的心肌细胞面积明显增大,同时心肌细胞中的心肌细胞肥大标志物ANP、β-MHC的mRNA表达水平均明显升高。而AdCARD6转染细胞的以上检测指标均比AdGFP组明显降低。第五部分:Western blot检测发现,在AB术后4周,CARD6基因敲除(KO)组心肌组织及心肌细胞中的MAPK家族成员MEKK1及其下游因子MEK-ERK1/2和JNK1/2的蛋白磷酸化水平明显增加,而CARD6基因过表达(TG)组的蛋白磷酸化水平则显著降低。结论通过主动脉缩窄术建立压力性负荷诱导的小鼠心肌肥厚模型,我们发现心脏特异性CARD6基因敲除促进了心肌肥厚和心肌纤维化的发生发展,而特异过表达CARD6则抑制了心肌肥厚和纤维化。同时,进一步研究发现CARD6作用于MAPK家族成员MEKK1并抑制其下游因子MEK-ERK1/2和JNK1/2介导的心肌肥厚信号通路的激活。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R542.2

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