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《南京医科大学》 2016年
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人IRF-5基因的转录调控机制研究

束进  
【摘要】:目的:分析系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)患儿与健康儿童外周血中干扰素调节因子5(interferon regulatory factor 5, IRF-5)、IFN-α及Sp1基因的差异表达;克隆人IRF-5的启动子并寻找其核心启动子区域;鉴定调控IRF-5的关键转录因子;探索组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors, HDACi)及组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase, HAT)对IRF-5表达的影响及相关机制。方法:提取12例确诊的SLE患儿及健康儿童的外周血单个核细胞,实时荧光定量PCR检测TRF-5、IFN-α及Sp1的表达;采用PCR方法获取IRF-5基因5’侧翼序列及一系列5’端缺失体,定向插入到pGL3-Basic载体中,双萤光素酶报告基因检测系统鉴定其启动子活性;TFSEARCH在线软件及JASPAR database预测IRF-5核心启动子区域潜在的转录因子结合位点,利用点突变技术、RNA干扰、转录因子过表达、凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)及染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecitation, ChIP)等实验,鉴定调控IRF-5的关键转录因子;观察2种HDACi-曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)、丙戊酸钠(valproic acid, VPA)及2种HAT-P300、PCAF对IRF-5启动子活性、mRNA及蛋白表达的影响,利用酶联免疫吸附试验检测TSA、VPA对受诱导的THP-1细胞上清液中IFN-α、TNF-α表达的影响,用ChIP-qPCR实验观察TSA、VPA对Sp1、Pol Ⅱ、HDAC3、P300及PCAF与IRF-5启动子区结合的影响。结果:1.SLE患儿中IRF-5、Sp1及IFN-α的表达较健康儿童升高55%、61%及85%,Sp1、IFN-α的表达与IRF-5呈正相关(P0.05)。2.IRF-5一系列截短的质粒萤光素酶活性分析显示:从-1760 bp缺失到-179bp位后,仍具有较高的启动子活性,但从-179 bp位缺失到-40 bp位时,启动子活性显著下降,提示IRF-5核心启动子位于-179-+62 bp区域。3.生物信息学预测该区域包含了3个Spl的结合位点,点突变、RNA干扰、转录因子过表达、EMSA、ChIP及实时荧光定量PCR等实验证明Spl能与IRF-5的启动子区结合并正向调控IRF-5的表达。4.TSA、VPA下调IRF-5的表达并抑制受诱导的THP-1细胞上清液中IFN-α、 TNF-α的释放,P300下调IRF-5的表达,而PCAF对IRF-5的表达没有影响,ChIP-qPCR实验检测发现TSA及VPA抑制Sp1、Po1Ⅱ、HDAC3、P300与IRF-5启动子区的结合,而对PCAF与IRF-5启动子区的结合没有影响。结论:1.SLE患儿中IRF-5、Sp1及IFN-α的表达高于健康儿童,Sp1、IFN-α的表达与IRF-5呈正相关,提示IRF-5可能参与儿童SLE的发病。2.人IRF-5基因的核心启动子区域位于-179至+62 bp处,Spl能够正向调控IRF-5的表达,从而为治疗IRF-5基因相关的疾病提供靶点。3.TSA、VPA下调IRF-5的表达,并抑制IFN-α、TNF-α的释放,P300能下调IRF-5的表达,而PCAF对IRF-5的表达没有影响,为HDACi治疗SLE等免疫性疾病提供了理论依据。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R725.9

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