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《南京医科大学》 2014年
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H_2S缓释剂SMP-12抗动脉粥样硬化及其机制研究

梁小燕  
【摘要】:目的动脉粥样硬化(AS)严重危害着人类的健康,其中脂质代谢紊乱并伴随炎症是AS的主要发病原因,而泡沫细胞的形成是其核心环节。提示HMG-CoA还原酶、LDLR以及炎症因子NF-κB、COX-2表达异常都严重影响着AS的发生发展。H2S作为新颖的气体信号分子,被广泛用于AS、高血压、肿瘤等方面的研究,研究表明H2S具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗纤维化、细胞保护、舒张血管、保护心肌、抗AS等作用。本次实验采用的SMP-12是以SMP-10为载体的H2S缓释剂,其性质稳定,克服了外源性H2S供体NaHS易氧化性、H2S饱和溶液的配制毒性,同时其缓慢释放H2S的特性很好的弥补了以上H2S供体的快速释放性从而更好地模拟内源性的H2S。本研究观察该缓释剂对AS的作用,并与NaHS对比,深入探讨其抗AS作用机制。方法动物实验:SD健康雄性大鼠25只,清洁级,体质量(230±10)g。随机分为5组,每组5只进行为期3个月的造模。①正常组:基础饮食;②模型组:高脂饮食+生理盐水灌胃;③NaHS组:高脂饮食+NaHS灌胃;④SMP-12组:高脂饮食+SMP-12灌胃;⑤SMP-10组:高脂饮食+SMP-10灌胃。除正常组以外的各组大鼠定期腹腔注射维生素D3加速钙化,累计注射维生素D380万单位。造模前后分别检测血浆TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。进行主动脉、肝脏切片HE染色,血浆H2S含量测定,并通过总胆固醇测定试剂盒测定肝脏的总胆固醇,同时通过qRT-PCR、Western-blot技术分别提取肝脏RNA、蛋白进行HMG-CoA还原酶、LDLRmRNA及蛋白的定量。细胞实验:采用小鼠RAW264.7巨噬细胞株进行培养及传代,取对数期的细胞接种到6孔板。正常组:无血清培养基培养48小时。模型组:无血清DMEM_中加入终浓度为60mg/LOx-LDL培养48h;NaHS、SMP-12、SMP-10组:无血清DMEM中加入终浓度为60mg/L Ox-LDL培养24h后分别加入NaHS(250μmol)、SMP-12(25μmol)、SMP-10(50μmol),继续培养24h后进行相应实验。采用油红O染色、酶法检测巨噬细胞内脂质积聚的情况,同时收集6孔板各组细胞提取RNA、蛋白,进行 NF-κB、COX-2 的 qRT-PCRmRNA 的定量及 Western-Blot 蛋白测定。结果动物实验结果:造模前大鼠血脂均正常且无组间差异;造模后给予高脂饮食的四组与正常组比较TC、LDL-C升高,NaHS组、SMP-12组、SMP-10组与模型组比较TC、LDL-C降低且SMP-12组降低最明显,同时SMP-12组HDL-C升高,均有统计学意义。主动脉切片HE染色光镜下可见正常组主动脉壁薄厚均匀,内膜光滑,中膜平滑肌细胞排列整齐,未见AS斑块形成;模型组主动脉病变严重,可见明显的粥样硬化斑块形成并脱落,SMP-12组、NaHS组粥样硬化病变明显减轻,尤其SMP-12组给药后血管壁完整,仅有部分增厚,未见斑块形成。肝脏切片HE染色后,镜下观察肝细胞的形态改变。正常肝细胞呈多边形,体积较大,排列整齐,中央有大而圆的核,胞内无脂滴沉积,肝小叶规则。模型组和SMP-10组均见肝细胞肿胀,胞质中出现大小不等的脂滴空泡,以大泡性脂肪滴为主,核居边,细胞边界不清。NaHS、SMP-12组肝细胞内脂滴明显减少,脂滴空泡减少,尤其以SMP-12组肝细胞病变程度最轻,上述结果与肝脏总胆固醇测定结果相符。证实动脉粥样硬化模型制备成功。血浆H2S含量检测显示模型组H2S含量较正常组降低;NaHS组、SMP-12组显著升高,且SMP-12组血浆H2S含量最高,均具有统计差异。提取肝脏的RNA、蛋白进行HMG-CoA还原酶、LDLR的qRT-PCR及Western-blot检测显示SMP-12组、NaHS可显著降低HMG-CoA还原酶mRNA及蛋白水平,升高LDLR mRNA及蛋白的表达。细胞实验结果:Ox-LDL导致细胞内脂质沉积,提示泡沫细胞形成。SMP-12、NaHS、SMP-10均可以抑制巨噬细胞内脂质积聚,抑制泡沫细胞的形成,以SMP-12组抑制作用最明显。SMP-12及NaHS可抑制NF-κB、COX-2mRNA及其蛋白的表达,从而减少了相关促炎因子的表达,其中SMP-12减轻炎症的效果更好。结论H2S缓释剂SMP-12、NaHS具有抗动脉粥样硬化作用且SMP-12效果强于NaHS,其作用机制可能与NaHS、SMP-12抑制炎症因子NF-κB、COX-2表达,降低HMG-CoA还原酶、升高LDLR的表达有关,SMP-12效果更佳,为临床上治疗AS提供了新的治疗方向和思路,具有潜在的临床应用价值和理论意义。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R543.5

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