收藏本站
《南京医科大学》 2017年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

利用CRISPR/Cas9系统构建基因编辑猴及CRISPR/Cas9系统应用优化

崔益强  
【摘要】:当前医学及生命科学研究中,动物模型是不可或缺的组成部分。生命科学研究中每一种模式动物研究的突破,为遗传学、分子生物学、发育生物学等研究领域带来了突破式的进展。随着科学研究的不断深入,人类对复杂生命现象的不断探索,以及人类面临的重大疾病(癌症,艾滋病,心脑血管疾病,神经性疾病等)的威胁,低等的动物模型已无法满足复杂的科学研究以及模拟人类重大疾病的需求。非人灵长类动物作为人类的近亲,具有与人类相似的免疫系统、神经系统以及代谢系统,是最理想的甚至是唯一的模型动物。许多灵长类动物的研究成果可直接应用于人类疾病的预测、预防、诊断和治疗,而这些方面一直是人类健康领域关注的焦点。目前,非人灵长类动物模型构建一直受到编辑效率低、操作困难等限制,这些困难成为制约非人灵长类动物模型研究的瓶颈。近年来,基因编辑技术领域发展迅速,新型基因编辑工具不断被开发,尤其是CRISPR/Cas9基因编辑系统的出现,使基因编辑技术进入了新的时代。目前基因工程定点基因编辑工具中,可设计目标序列的定点核酸内切酶主要有三种,即:ZFN(锌指核酸酶),TALEN(转录激活子样效应因子核酸酶)和CRISPR/Cas9(规律成簇的间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白9)系统。其中CRISPR/Cas9系统,以其设计构建方便,敲除效率高,应用范围广等优势,被广泛应用于基因编辑研究中。因此,对CRISPR/Cas9技术的改造优化,并将其运用于构建非人灵长类动物基因编辑模型是生命科学所迫切需要的研究内容。本文综合运用CRISPR/Cas9基因编辑系统,针对Nr0b1,Pparg-γ,Rag1三个基因共设计5个sgRNA,其中Nr0b1与早期性腺发育相关,Pparg-γ与脂肪代谢相关,Rag1与免疫系统相关。通过对食蟹猴受精卵一细胞时期显微注射Cas9mRNA与sgRNA的混合体系,移植入代孕猴,成功构建定点基因敲除猴。通过对流产猴配子的基因鉴定,确认CRISPR/Cas9引入的基因编辑可以传递于配子,提示该基因编辑可以传递给子代。接着,针对食蟹猴Oct4(Pou5f1)基因3'UTR区设计sgRNA,并构建同源重组质粒5'Arm-IRES-hrGFP-3'Arm,通过对食蟹猴受精卵显微注射Cas9mRNA、sgRNA与供体质粒5'Arm-IRES-hrGFP-3'Arm混合体系,移植入代孕猴,利用细胞同源重组修复机制,将外源hrGFP定点插入目的基因Oct4的3'UTR区,成功获得定点基因敲入食蟹猴。在研究基因缺陷导致的疾病中,除基因缺失而直接影响基因表达以外,大数据的筛查结果显示,许多单核苷酸改变的多态性或突变位点,或者短的碱基插入删除(Indel)也与多种疾病关联。为了很好地模拟人类疾病的这类遗传学改变,以及模拟该类致病突变位点的修复。本文利用单拷贝BFP基因的293T细胞系作为研究工具,优化ssODN的设计方法。针对BFP与GFP差异位点附近设计不同的ssODN和sgRNA,利用重组后细胞荧光的比例来判断重组效率。通过综合比较不同的设计的ssODN,以及ssODN与sgRNA的不同位置组合,发现利用互补链ssODN并且突变位点位于切口位置3 '方向时,重组率相对较高。随后,利用CRISPR/Cas9系统,结合单链寡核苷酸供体(ssODN)进行小鼠胚胎共注射,利用ssODN作为同源重组模板,进行同源重组修复,成功构建了Usp42,Cep41 Fbxo47三个定点突变小鼠模型,为非人灵长类动物模型基于ssODN的基因编辑奠定了基础。本研究将CRISPR/Cas9基因编辑系统应用于非人灵长类动物——食蟹猴,结合显微注射技术,成功构建出定点基因编辑食蟹猴。通过对阳性流产猴配子的基因鉴定,提示CRISPR/Cas9技术产生的基因编辑在食蟹猴中可以传递给子代。利用CRISPR/Cas9技术结合同源重组技术,获得了定点基因敲入食蟹猴。并利用细胞系和小鼠模型进一步优化了以ssODN作为同源重组模板进行点突变模型构建中的设计方案,根据ssODN与sgRNA相对位置的不同设计分组实验,发现ssODN的设计以及与sgRNA相对位置与重组效率有关,为进一步在灵长类模型的应用奠定了很好的基础。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R-332

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 沈培清;;非人灵长类动物转运和检疫操作的暂行规定[J];上海实验动物科学;1992年01期
2 陈景轩;魏盛;薛玲;;非人灵长类动物情绪的研究进展[J];医学综述;2013年24期
3 魏振年;发展我国非人灵长类动物实验之浅见[J];上海实验动物科学;2003年01期
4 刘龙山;王长希;齐世杰;尚文俊;曾纪晓;滕若冰;耿祥飞;赵鸿;何晓顺;陈惠方;;50只非人灵长类动物肾移植模型的建立[J];广东医学;2006年03期
5 代小伟;朱华;刘颖;丛喆;蒋虹;秦川;;非人灵长类动物胃镜检测技术的建立[J];中国比较医学杂志;2008年09期
6 江鹏亮;汤球;余琛琳;崔淑芳;;非人灵长类动物模型在医学研究中的应用概况[J];实验动物科学;2010年06期
7 李晓燕;卢选成;武桂珍;;非人灵长类动物感染性实验生物风险分析[J];中国公共卫生管理;2011年05期
8 胡正飞;;在饲养非人灵长类动物中如何加强福利保障[J];当代畜牧;2012年08期
9 魏振年,刘国璋,莫祥铭;非人灵长类动物实验的回顾与展望[J];上海实验动物科学;1995年04期
10 秦晓菲;袁芳;潘晓靓;王庆利;常艳;;非人灵长类动物的发育神经毒性评价方法[J];中国新药杂志;2014年05期
中国重要会议论文全文数据库 前6条
1 匡德宣;唐东红;李春花;代解杰;;非人灵长类动物临床症状与疾病初步诊断的探讨[A];第九届中国实验动物科学年会(2010新疆)论文集[C];2010年
2 杨世华;陈乾生;李小航;;建立非人灵长类动物无B病毒种群的研究[A];中国实验动物学会第五届学术年会论文汇编[C];2000年
3 和占龙;赵远;鲁帅尧;唐永明;陈丽雄;王俊斌;李仕成;杨亮宇;;非人灵长类动物的应激反应与控制[A];中国实验动物学会第七届学术年会论文集[C];2006年
4 张高红;李明华;郑永唐;;非人灵长类动物模型在AIDS疫苗研究中的应用[A];中华中医药学会防治艾滋病学术研讨会暨2006年年会论文集[C];2006年
5 李东侃;侯家敏;沈官莲;黄维艺;詹桂林;;非人灵长类动物实验中心猕猴眼压情况[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年
6 张秀娟;李学家;颜孙兴;夏机良;刘晓明;彭白露;;中老年食蟹猴群中糖尿病相关基因的表达状态[A];第九届中国实验动物科学年会(2010新疆)论文集[C];2010年
中国重要报纸全文数据库 前2条
1 记者 白毅;我国培育成功首例转基因猕猴[N];中国医药报;2010年
2 本报记者 冯卫东;工业革命造就了癌症恶魔[N];科技日报;2010年
中国博士学位论文全文数据库 前3条
1 崔益强;利用CRISPR/Cas9系统构建基因编辑猴及CRISPR/Cas9系统应用优化[D];南京医科大学;2017年
2 徐玉振;非人灵长类动物急性肝功能衰竭模型的建立[D];南方医科大学;2010年
3 于长清;HIV-1跨种传播限制性和易感非人灵长类动物模型初步研究[D];中国农业科学院;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 周建华;福建省非人灵长类动物实验技术服务平台规划与建设[D];福建农林大学;2008年
2 李鑫;Vertical Chamber诱导的成年雌性食蟹猴抑郁模型[D];重庆医科大学;2012年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026