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《南京医科大学》 2017年
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白果内酯对缺血性脑损伤的神经保护作用及其机制研究

华骏  
【摘要】:脑卒中是当前全球第三大致死类疾病,仅次于心血管疾病和癌症,而在我国,脑卒中已成为最主要的致死因素,也是导致重度、慢性成人残疾的主要原因,严重危害人类的生命与健康。根据其临床发病特点不同,可以将脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中两大类。据统计,全球范围内缺血性脑卒中患者约占所有卒中患者的70%,而我国缺血性脑卒中约占所有卒中病例的85%,死亡率高达50%,存活的缺血性脑卒中患者中约有3/4不同程度地丧失劳动能力或遗留有瘫痪,失语等严重的后遗症。近年来人们致力于研究缺血性脑损伤急性期的神经损伤性级联反应,并在动物模型上已发现很多具有神经保护作用的化合物,但转化后的临床疗效均不太理想。因此,阐明缺血性脑损伤的确切病理机制,提出新的卒中后神经保护策略,研发疗效确切并能让更多患者受益的治疗药物仍然是当前脑卒中治疗亟待解决的问题。此外,由于各种条件限制,能够在缺血性脑损伤"黄金3小时"内接受治疗的患者很少,多数患者在急性期接受保守治疗,损伤后期主要依靠神经营养和神经修复,通过促进机体内在的修复能力尽可能恢复患者的意识、感觉、认知和运动功能,并且这已经成为卒中后护理和治疗的关键所在。因此,发现促进卒中后期神经修复的关键机制和分子靶标,研发理想的恢复期治疗药物也已经成为脑卒中研究领域的热点。细胞自噬与凋亡是目前卒中机制研究比较重要的热门领域。缺血性脑损伤后脑组织主要因供血、供氧不足会发生神经细胞的坏死与凋亡。其中,缺血半影区脑组织主要发生细胞凋亡,一种受多基因严格控制的死亡方式。细胞自噬是机体内在调整稳态的有效机制,缺血缺氧引起的细胞内错误折叠或者不折叠的蛋白、受损的细胞器均需要通过自噬途径被运送至溶酶体降解,不能够及时被清除的病理因素会导致细胞凋亡或死亡。神经细胞在缺血、缺氧情况下激活保护性细胞自噬减少凋亡相关蛋白向线粒体内的聚集,通过减少细胞色素C或Caspase-3的活化从而抑制细胞凋亡。因此,研发可以靶向调节神经细胞保护性自噬并抑制细胞凋亡的药物,能够在缺血性脑损伤早期减少神经细胞死亡,减轻神经功能损伤。银杏是一种有着较早文献记载并具有重要药用价值的天然植物,在我国作为药用已有五千多年的历史,长期应用于防治心血管疾病,抗老防衰,抗癌和提高自身免疫力等方面。研究表明,银杏叶和银杏果中含有多种药用成分可用于多种疾病的防治,成分主要是银杏内酯A、B、C、J、M和白果内酯(bilobalide,BB)。其中白果内酯是从银杏叶中提取出的唯一一种倍半萜内酯,具有抗兴奋性毒性、抑制氧化应激损伤、抗炎以及抗血小板聚集等作用,主要以与其他银杏叶提取物联合制剂的形式应用于脑血管相关疾病的临床治疗。目前白果内酯含量较高的制剂是用于脑部、周围血流循环障碍的银杏叶提取物注射液金纳多(白果内酯含量约占标准提取物的2.9%);另有金阁莱(?)银杏内酯注射液,其中白果内酯含量高达48%,主要用于缺血性脑卒中恢复期脑梗死适应症的治疗。然而,尽管临床应用表明含白果内酯的混合制剂对脑卒中具有较好的疗效,但其具体有效成分不明,白果内酯单体对缺血性脑卒中急性期和恢复期的疗效和确切机制也不清楚,因此也限制了其在缺血性脑损伤及适应症治疗中的应用。本课题在前期研究发现含有白果内酯的银杏内酯注射液能够减轻缺血性脑卒中急性期损伤的基础上,进一步研究白果内酯对小鼠大脑中动脉阻塞(transient Middle Cerebral Artery Occlusion,tMCAO)形成的局灶性缺血性脑损伤急性期和恢复期神经损伤及其神经功能恢复的治疗作用,并阐明其相关机制。第一部分白果内酯对缺血性脑损伤急性期神经保护作用及其与自噬的相关性目的:建立小鼠缺血性脑损伤再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)模型,研究白果内酯对急性期神经损伤的保护作用,及对神经元自噬和凋亡的调节,为深入阐明白果内酯的作用机制并拓展其临床应用积累学术基础。方法:(1)参考Longa法制备小鼠tMCAO模型,于缺血1h、血流再灌注6h后分组给予金纳多(10 mg/kg),3.5 mg/kg,7 mg/kg和14 mg/kg白果内酯(BB,i.p.,bid)治疗。血流再灌注72h后神经功能评分,处死取材TTC染色,脑含水量测定。(2)制备小鼠tMCAO模型,并选取最小有效剂量7 mg/kg BB于血流再灌注6h后给药,再灌注72h后处死分别取组织脑片和缺血半影区脑组织,利用免疫组织化学方法标记缺血半影区NeuN+神经元,免疫荧光测定自噬相关蛋白LC3和凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase 3与神经元的共标情况,Western Blot法分别对缺血半影区组织LC3,p62,Beclin1,BcL-2,Bax和Cleaved-Caspase 3等指标进行检测。(3)离体培养神经元细胞株N2a经离体氧糖剥夺模型(oxygen glucose deprivation,OGD)3h后,分别复糖复氧(Reoxygenation)0、3、6、12 和 24h,Western Blot 法分别检测胞内 LC3、p62、Beclin1、BcL-2、Bax和Cleaved Caspase-3等蛋白水平,观察复糖复氧后不同时间点自噬和凋亡的水平,并选择合适复糖复氧时间。(4)N2a细胞OGD3h后,用含不同浓度BB(0.01、0.1、1、10、25和50 μM)的完全培养基复糖复氧24h,MTT法评价药物对细胞活力的影响。(5)N2a细胞OGD 3h后,用含有1μM BB的完全培养基复糖复氧24h,利用Western Blot法分别进行自噬相关蛋白LC3、p62和凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3等指标进行检测。(6)N2a细胞OGD 3h后,同时给予细胞含2.5 mM自噬抑制剂3MA和1μM BB的完全培养基复糖复氧24h,利用流式细胞仪和Western Blot法检测细胞凋亡。结果:(1)BB(7,14mg/kg)能够减少小鼠脑梗死体积,降低神经功能评分和脑含水量。(2)7 mg/kg BB能够减少tMCAO模型后小鼠缺血半影区神经元的丢失。(3)7 mg/kg BB能够升高模型72h后小鼠缺血半影区脑组织LC3荧光表达并抑制Cleaved Caspase-3荧光表达,其中LC3与Cleaved Caspase-3荧光都与神经元细胞有部分共标。(4)7 mg/kg BB治疗能够降低小鼠缺血半影区脑组织凋亡相关蛋白Bax,Cleaved Caspase-3,自噬底物蛋白p-62蛋白的表达,并升高BcL-2、LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达。(5)N2a细胞OGD/R后3h自噬水平较对照组升高,并随着时间推移细胞自噬水平下降,而细胞凋亡水平上升。(6)WB结果显示,BB促进复糖复氧24h后N2a细胞BcL-2、LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达,并降低Bax,Cleaved-Caspase 3,自噬底物蛋白p-62蛋白表达。(7)自噬抑制剂3MA能够部分取消BB对Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达的抑制作用;流式细胞术结果显示白果内酯能够减少处于早期凋亡和晚期凋亡及坏死的细胞数目,而3MA部分取消BB对N2a细胞凋亡的抑制作用。结论:自噬参与白果内酯对缺血性脑损伤急性期的神经保护作用。第二部分白果内酯对缺血性脑损伤恢复期神经再生的调节及其机制目的:研究BB对缺血性脑损伤恢复期神经再生的调节作用,阐明其对成体神经干细胞增殖、分化等功能的影响与机制,为揭示其脑卒中恢复期用药的促神经修复功能提供直接的实验依据。方法:参考Longa法制备小鼠I/R损伤模型,缺血1h、血流再灌注24h后利用神经功能评分进行模型筛选,将模型成功小鼠随机分为模型对照组(Vehicle组),白果内酯3.5 mg/kg、7mg/kg和 14mg/kg给药组(BB 3.5 mg/kg,7 mg/kg,14 mg/kg,i.p.,bid),给药14天和42天分别进行内源神经干细胞增殖和分化相关实验:(1)统计术后各组小鼠死亡率和体重,并分别于术后1、3、7、14、28和42天进行神经功能评分,3、7、14、28和42天进行踏空测试,于术后14和28天进行转角和转棒测试,分别记录小鼠足失误次数、右转率和从转棒滑落时间,评价BB对I/R损伤恢复期小鼠神经感知、运动功能的影响。(2)术后38-42天对小鼠进行Morris水迷宫测试,评价BB对小鼠空间学习与记忆能力的影响。(3)利用小动物MRI-T2加权成像技术在术后24h、7d、14d和42d在体观察模型及14mg/kgBB治疗组小鼠脑组织损伤情况。(4)术后12-13天给予小鼠腹腔注射 BrdU(5-Bromo-2-deoxy Uridine,Sigma;50 mg/kg,连续给药4次,给药间隔为12h)标记S期增殖细胞,术后14天用于研究干细胞增殖的小鼠灌注取脑,完成BrdU免疫组化,评价干细胞增殖情况;用于研究干细胞分化的小鼠于术后42天灌注取脑,完成BrdU/NeuN免疫荧光,评价干细胞向神经元定向分化的情况;同时,为探讨药物对神经再生调节的机制,离体实验培养成体神经干细胞研究药物对干细胞存活、增殖和分化的影响,并初步探讨其作用机制。(5)离体培养成体神经干细胞(Adult neural stem cells,ANSCs),利用MTT和细胞计数法分别观察OGD/R和不同浓度BB(0.01、0.1、1、10和50 μM)给药对神经干细胞细胞活力和自我更新的影响。(6)利用BrdU免疫荧光标记法和流式细胞术评价BB对干细胞增殖和细胞周期的影响。(7)利用免疫荧光标记法观察OGD/R7天后神经干细胞向神经元(Tuj-1)和星形胶质细胞(GFAP)分化的比率以及不同浓度BB(0.1、1和10 μpM)对干细胞定向分化能力的影响。(8)检测OGD/R24h后,Western Blot法检测不同浓度BB(0.1,1和10 μM)对细胞p-Akt,p-p38和p-JNK水平的变化影响。(9)利用JNK激动剂茴香霉素(Anisomycin,Anis)预处理干细胞24h后,OGD2h后复糖复氧给予BB和Anis干预7天,免疫荧光法观察OGD/R 7天后BB对神经干细胞向Tuj-1神经元分化的影响。结果:(1)BB(7,14mg/kg)治疗小鼠长期存活率高于I/R模型小鼠,并且BB可以缓解I/R损伤导致的小鼠体重降低。(2)与模型对照组小鼠相比,7和14mg/kgBB治疗组小鼠神功功能显著改善,转角测试中右转率降低,转棒测试中棒上停留时间延长,同时,在踏空测试中踏空率显著降低。(3)Morris水迷宫定位航行测试中,BB能够降低小鼠找到水下平台的时间,同时在空间探索测试中BB能够增加小鼠穿越平台次数,增加小鼠在平台象限穿越的时间及次数。(4)MRI观察到术后24h模型小鼠损伤侧脑组织存在大面积高亮度信号,7天后信号变弱并出现脑组织缺损,14天时组织缺损边缘出现高密度信号,42天组织梗死导致的缺损体积相对固定,而给予14 mg/kgBB治疗能够延迟脑组织缺损的出现并减少梗死导致的脑组织缺损。(5)7mg/kg和14mg/kgBB增加术后14天小鼠SVZ和SGZ神经干细胞的数目和分布范围。(6)7mg/kg和14mg/kg BB增加术后42天小鼠SVZ和SGZ区BrdU+/NeuN+细胞数目。(7)0.1、1、10和50 μM BB能够增加OGD/R后ANSCs细胞活力且能够增加生长7天后神经球直径和个数。(8)BB增加OGD/R后BrdU+的ANSCs数目,并且能够增加处于S期的细胞数目。(9)BB促进OGD/R 7天后ANSCs向Tuj-1+神经元的分化。(10)BB抑制OGD/R后ANSCs内p38和JNK的磷酸化水平的升高,同时升高Akt的磷酸化水平。(11)10 μM JNK激动剂茴香霉素取消BB促进ANSCs向神经元分化的作用。结论:BB促进缺血性脑损伤恢复期神经再生,增强神经功能修复。综上所述,本文工作的主要创新之处在于:1.发现白果内酯在I/R模型小鼠急性期的抗凋亡作用与调节自噬相关通过对I/R经典动物模型研究发现,白果内酯对缺血性脑损伤的急性期损伤包括神经运动障碍、脑梗死和脑水肿均具有显著改善作用,并且白果内酯可以促进神经元自噬并抑制神经元凋亡;同时,离体研究证实白果内酯通过促进神经细胞自噬并抑制神经元凋亡。研究为揭示白果内酯在缺血性脑损伤急性期的神经保护作用提供了直接的实验证据,为拓展其在缺血性脑损伤急性期的临床应用积累了重要学术基础。2.发现白果内酯在小鼠缺血性脑损伤恢复期发挥促神经再生作用研究发现白果内酯能改善缺血性脑损伤恢复期神经运动功能,并且能促进内源性神经再生。同时,离体实验确证白果内酯能够促进成体神经干细胞存活、自我更新、增殖和向神经元的分化,并且其对分化的积极作用与其对神经干细胞JNK MAPK通路的抑制作用相关。研究深化了对白果内酯应用于缺血性脑损伤临床恢复期的作用机制的认识,并为推广白果内酯联合制剂和单体制剂在防治缺血性脑损伤中的临床应用提供重要的理论依据。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R285.5

【参考文献】
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