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《南京医科大学》 2019年 硕士论文
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猪naive-like胚胎干细胞的鉴定及体外定向诱导分化的研究

王晨宇  
【摘要】:研究背景:Naive状态的胚胎干细胞一直被研究者们认为是真正的胚胎干细胞,然而迄今为止,有蹄类大动物的naive胚胎干细胞始终未能成功建系。最新研究表明,利用携带转录因子的慢病毒载体转染猪的囊胚内细胞团,然后将内细胞团接种于含2i(CHIR99021和PD0325901)的LIF培养液中,可以获得猪类naive胚胎干细胞,然而这样获得的猪类naive胚胎干细胞由于来源于可能携带不同拷贝外源转录因子的不同的卵裂球,而不具有均一性。本实验室此前将经典的鼠源多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc(mOSKM)表达载体通过核转染技术转入猪胎儿成纤维细胞(PEF),再通过体细胞克隆技术获得胚胎,并将其内细胞团接种于含3i(CHIR99021,PD0325901,SB431542)的LIF培养液中,成功建立了猪naive-like胚胎干细胞系,但尚未对所建细胞系的内外源转录因子的表达进行较为系统的研究。目前关于猪多潜能干细胞定向分化为神经细胞鲜有报道,猪多潜能干细胞体外诱导神经细胞的分化缺少相关文献支持,因而尚无确切的猪胚胎干细胞定向分化诱导为神经细胞的方法。此外,猪类胚胎干细胞体外诱导分化为中胚层的方法尚无确定的标准,关于人和鼠胚胎干细胞向中胚层谱系类肾细胞分化的研究方法主要有特定诱导因子定向诱导分化、肾细胞共培养诱导胚胎干细胞分化和经拟胚体途径定向分化等策略。本研究利用本实验室所建立的猪naive-like胚胎干细胞系,在对其干细胞特性进行进一步鉴定和验证的基础上,研究了外源转录因子对内源Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc启动表达的影响及猪naive-like胚胎干细胞体外定向分化的能力,为获得主要内源转录因子全面启动的猪胚胎干细胞以及猪多能干细胞体外定向分化方法的建立提供参考。研究目的:鉴定猪naive-like多能干细胞内外源多能基因的表达情况;研究猪naive-like胚胎干细胞向外胚层谱系神经前体细胞和中胚层谱系肾前体细胞分化的能力。研究方法:对已建立的猪naive-like胚胎干细胞系进行多能因子免疫荧光染色,并通过Q-PCR和免疫荧光染色鉴定细胞系特征;所建立的1、4号细胞系经去除DOX培养后,提取细胞系总RNA,反转录为cDNA,设计Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc引物进行RT-PCR后切胶回收,转化涂板挑克隆后送测序,通过对比内外源克隆占比了解细胞系在去除DOX培养后内外源基因的表达变化程度;利用小分子化合物β-巯基乙醇、B-27、肝素等组成的神经诱导培养液,采用直接分化法,分化得到神经前体细胞,通过RT-PCR和Q-PCR对其进行神经特异性基因表达鉴定,同时检测分化后的细胞是否已经丧失多能性,通过Western Blot和细胞免疫荧光检测神经标志物Nf-l、βIII-Tubulin的表达水平;利用小分子BMP4、Activin A、CHIR99021、FGF9、Herparin和RA,采用三步法,获得肾前体细胞,通过RT-PCR和Q-PCR对其进行肾特异性基因表达鉴定,并通过Western Blot和免疫荧光检测肾细胞标志物WT-1的表达量。研究结果:对猪naive-like胚胎干细胞系进行多能因子免疫荧光染色,结果显示Oct4、Sox2在细胞中基因高表达,通过Q-PCR证明naive-like状态的细胞与primed状态相比Xist基因表达要低,且在雌性细胞系中,通过细胞免疫荧光发现primed状态的有巴氏小体存在,而naive-like状态的几乎没有巴氏小体存在,证明获得的naive-like ESCs更趋近于naive状态;去除DOX培养1号和4号猪naive-like胚胎干细胞系,通过TA克隆测序发现1号细胞系在去除DOX之前内源OSKM四个转录因子均有所表达,内源表达量分别占总表达量的3.2%、35.0%、9.4%和9.5%,去除DOX后,内源Sox2和c-Myc的表达分别提高至78.3%和21.7%,而内源Oct4和c-Myc未见提高。4号细胞系在DOX存在的情况下,只有内源Sox2有所启动表达,占比为10.0%,在去除DOX之后,内源Sox2的表达最高达到100%,而内源Oct4、Klf4和c-Myc均未启动表达。通过小分子诱导分化所得到的神经前体细胞具有明显的神经细胞结构特征,RT-PCR显示分化后的神经前体细胞表达多种神经细胞特异性基因,Q-PCR结果显示分化后多能因子的表达显著降低,神经特异性基因表达显著升高。免疫荧光染色结果和Western Blot显示细胞表达神经标志物βIII-Tubulin和Nf-l。利用小分子先将猪naive-like胚胎干细胞诱导至中间中胚层,再通过不同的小分子组合将中间中胚层细胞诱导为肾前体细胞,RT-PCR和Q-PCR鉴定结果表明分化细胞其中胚层谱系及肾细胞相关基因表达显著增高,Western Blot和免疫荧光结果显示分化后的肾前体细胞中表达肾脏标志物Wt-1。研究结论:验证了猪naive-like胚胎干细胞系的干细胞特性,不同的细胞系内外源转录因子的表达情况不尽相同,但所建细胞系都一定程度上依赖于外源转录因子的表达。在去除DOX诱导之后,内源Sox2的启动对于干细胞的生长及持续的自我更新至关重要。成功实现了体外直接诱导猪naive-like胚胎干细胞向神经前体细胞和肾前体细胞分化,为猪naive胚胎干细胞的建系及其诱导分化方法的建立提供参考。


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