重组腺相关病毒载体介导的人LCAT和/或apoA-I在肌源性细胞中的表达

【摘要】： 目的 卵磷脂胆固醇酰基转移酶（Lecithin：cholesterol acyltransferase，LCAT）是产生血浆中大部分胆固醇酯（CE）的 主要酶，并且是胆固醇逆转运（reverse cholesterol transfer，RCT） 中的一个关键因子。LCAT基因缺陷可导致血脂代谢异常和器 官损害；LCAT的过表达可促进胆固醇逆转运和降低致动脉粥 样硬化（AS）的含apoB脂蛋白水平，有助于防止或减轻AS 的发生、发展。本研究旨在探索用目前看好的重组腺辅助病毒 （rAAV）介导LCAT及其天然激活剂apoA-I在骨骼肌细胞中 共表达的可能性，为将来进一步对原发或继发性LCAT缺陷患 者或动脉粥样硬化高危人群发展一种安全、有效的基因治疗方 法打下基础。方法 构建含有人LCAT cDNA的rAAVL表达载 体以及含有LCAT cDNA-IRES-apoAI cDNA的rAAVAIL表达载 体。用rAAVAIL、rAAVL及pDG质粒转化JM109大肠杆菌， 经扩增、抽提及纯化后以磷酸钙共沉淀法将其转导入293T细胞 中包装。破细胞收集rAAV，以Iodixanol密度梯度离心继以肝 素亲和层析等方法分离、纯化及浓缩rAAV；斑点杂交鉴定制备 的rAAV颗粒数。以rAAVAIL/rAAVL转染小鼠肌源性细胞 C2C12，部分rAAVAIL转染的C2C12细胞以低血清培养液诱导 其分化为肌管细胞；收集不同时间的无血清培养液，以ELISA 及Western Blot法检测人apoA-I的表达，以~3H-胆固醇标记底物 的放射化学方法检测人LCAT的活性，提取被转染细胞基因组 以PCR法检测目的基因整合情况。结果 经Iodixanol密度梯 度离心后的rAAV物理颗粒数分别为7×10~(11)个/ml（rAAVAIL） 南京医科大学硕士学位论文 和卜 10n个／ml（rA”L L rA”能有效转染 CZCIZ 兰胞株并 介导人 pOA－I和／或 LCAT在该细胞中持续表达 30天；低血清 诱导 CZCIZ分化为多核的肌管细胞后仍保持这种表达能力。提 取被转染细胞基困组DNA，PCR检测证明LCAT、pOAJ基固 均已整合入细胞基因组。结论 本实验采取的制备、纯化 rAAV 的方法简便、高效；以 n’nH为载体能有效介导人 LCAT、apoA－I 基因在肌源性细胞中表达并分泌至细胞外。提示将该方法用于 骨骼肌组织进行纠正LCAT缺陷或抗AS的基因治疗有着广阔 白前景。

【关键词】：卵磷脂胆固醇酰基转移酶 载脂蛋白AI 胆固醇逆转运 动脉粥样硬化 重组腺相关病毒 骨骼肌细胞 基因转移
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：Q786
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