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《南京医科大学》 2003年
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C3d单抗的研制及其在滴金免疫测定C3d方面的初步应用

柏兵  
【摘要】: 背景 C3d是补体C3的裂解片段,是补体系统活化的标志。在多种补体系统参与的感染性疾病和自身免疫性疾病中,测定血浆C3d水平,有助于判断病情和疗效。在过去的近二十年中,C3d一直是研究的热点,国外不但对C3d的生成过程、分子结构、生物学活性等作了基础性研究,还研究了某些感染性疾病和自身免疫性疾病中C3d水平的变化,国内在这方面也作了不少实验研究。目前,市场上还没有C3d的纯品及其单抗供应,为了在临床上推广应用C3d的测定,并为深入研究提供方便,我们利用菊糖-C3b和PEG等,制备了C3d单抗和多抗,并研制了免疫金层析试条,对轻、中重型肝炎患者的血浆C3d水平进行测定,并对其临床意义作了初步研讨。 目的 研制C3d单抗并标记肢体金,利用免疫金层析测试法(immunochromatographic assay)快速、简便测定轻型、中重型乙型病毒性肝炎患者血浆C3d水平,以判断其体内补体活化情况。 方法 1.C3d单克隆抗体的制备 用菊糖活化并结合人新鲜血清中的补体C3b成分,制备菊糖-C3b,以此作为抗原去免疫BALB/c小鼠,制备杂交瘤。以羊抗C3IgG包被酶标反应板,并从人老化血清中捕获C3d,以此检测BALB/c小鼠血清C3d抗体,并筛选阳性杂交瘤。待BALB/c小鼠血清抗C3d阳性时,将其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合并用HAT培养基作选择性培养,通过检测杂交瘤上清中分泌C3d单抗情况,筛选阳性杂交瘤细胞,经扩增和多次亚克隆,直至所有单个细胞形成的克隆培养上清均呈C3d抗体阳性,可确定为单克隆抗体细胞系建立。将杂交瘤于BALB/c小鼠腹水中扩增,检测C3d单抗并收集和提纯。 2.C3d单抗的特异性的分析 利用protein G柱亲和层析提取单抗IgG和C3d复合体,一并做SDS-PAGE,根据分子量,判断与单抗特异结合的是否为C3d,间接证明C3d单抗的特异性。 南京医科大学硕士学位论文 3.C3d单抗标i己胶体金 将提纯的C3d单抗屹G进行低盐透析, 确定与胶体金标记的最适量,并在 pH约 8、0下进行标记。离。。 浓缩。 4.免疫金层析试条的制备 利用提纯的羊抗人瞩lgG和羊抗鼠 lgG分别在硝酸纤维膜上划线并封J札 与吸样材料、玻璃纤维膜 (免疫金垫料)、吸水材料组合在一起制备免疫金层析试条。根据 所测定的 30例正常人和 30例轻型、30例中重型肝炎患者血浆 C3d 水平确定试条应达到的检测限,通过在免疫金中加入不同浓度的 未标记胶体金(游离)的同克隆 C3d单抗来调整检测限。用这些 检测限不同的试条分别去测定样品中的C3d。 结果 l.SDS-PAGE电泳图上,出现清晰的三根条带,根据分子量 marker 判断,其分子量范围与lgG的轻链、重妓及C3d相符。 2.免疫金中未力 C3d游离单抗的试条勺灵敏度在 6-。10ng/ml(试条 1),力 0.lug/ml、0.Zug/nil游离单j;U0) 灵敏度则分另IJ为:10-15ng/ml (试条11)、15-20ng/ml。30佃J正常人在试条1和11检测下老为 阴性】 一 型U门二仅在试壳N立力卜-为3iH性】 而中上型j汁炎在试余 和*检坝下老为阳性。 结论 l.在没有 C3d纯品的情况下,利用菊糖C3b作为抗原;酶标反应板 包被C3 IgG多抗再捕获C3d作C3d单抗检测板,lA而制备C3d 单抗的方法是切实可行的。 2.用proteinG亲和柱提取单抗及其抗原;将该复合物一并做 SDS-PAGE,分析单克隆抗体的特异性,该方法比较简便。 3.通过在免疫金中加入游离的同克隆单抗,可以灵活控制斑点金免 疫层析试条的灵敏度。 {本免疫金层析测试法测定肝炎患者瞩d水平,可以判断补体活化 程度,辅助诊断乙型肝炎轻重分型。有初步的临床应用价值,并 有待于进一步开发研究。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R446.6

【参考文献】
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