生物人工肾小管的体外构建、功能优化、治疗MODS/MOF并ARF的实验研究

【摘要】：研究目的 探讨生物人工肾小管的体外构建方法，对急性肾衰竭合并多脏器功能障碍综合征／多器官衰竭(ARF并MODS／MOF)的治疗作用以及通过基因工程的方法使其功能进一步优化(肾小管上皮细胞永生化)，旨在体外能生物性模拟。肾小管功能，完善目前肾替代治疗只能替代肾小球滤过功能之不足，提高肾替代治疗的存活率。 方法 猪肾近曲小管上皮细胞株(LLC-PK1)体外培养后植入血液滤过器(FH66)中空纤维内腔继续培养。期间以MTS方法测定滤器内细胞活性。二周后在体外模拟液体滤过，测定钠离子(Na~+)、钾离子(K~+)、钙离子(Ca~(2+))、肌酐(Cr)、葡萄糖(Glu)及氨基酸重吸收功能的变化。并观察哇巴因、根皮苷对Na~+、Glu、氨基酸重吸收的影响。 应用盲肠结扎和穿孔(CLP)合并双侧输尿管结扎术(UL)制作MODS并ARF猪模型。随机分为RAD治疗组(A组)、假RAD治疗组(B组)、CVVH治疗组(C组)和未治疗组(D组)。观察生命体征、肝肾功能、细胞因子IL-10、TNF-α和生存时间。 在上述实验基础上，进一步构建永生化人肾近曲 正义 南京医科人学博}学位论文 小管上皮细胞株以优化RAD功能。人胚肾细胞株(293 细胞)培养后，用RT一PCR方法扩增出ad5EIA基因。 Kpnl和Ehol双酶切后与pshuttle CMV载体连接并测 序。联合应用Lipofectamine转染原代培养的人肾近曲 小管上皮细胞，筛选出阳性克隆，RT一PCR鉴定目的基 因的表达，免疫荧光测定蛋白表达。并用MTT及流式 细胞仪测定其生长特性。通过AKP、LDH、NAG及钠 钾ATP酶的检测明确转化后细胞的功能并与H KZ细胞 株作比较。 结果 采用上述方法构建的RAD体外实验中肌醉重吸 收率较对照组明显降低(P0.01);初始RAD组与 对照组的Na+、葡萄糖、氨基酸的重吸收率无明显差 异(P0.05)。液体中加入哇巴因及根皮普后，Na+、 葡萄糖、氨基酸的重吸收率明显降低且与对照组相比 有明显差异(P0.01)。祛除药物抑制因素后，重吸收 率又能恢复，与阴性对照组差异不明显(P0.05)。 利用RAD治疗MODs/ARF动物的实验中，四组 动物治疗前平均动脉压(MAP)无显著性差异。RAD 组(A组)治疗后血压逐渐回升，MAP显著高于同时 间点的假RAD组(B组)、常规CVVH组(C组)和 非治疗组(D组)(P0.01);四组动物治疗前血肌 醉(SCr)无显著差异;治疗24hA、C组SCr水平明 显低于B、D组(P0.05)，A、C组之间则无显著性 差异。A组治疗后IL一10的峰值显著高于其余三组 (P0.01)。A组治疗开始24小时后血TNF一a水平较 治疗前显著降低(P0.05)，亦低于同时间点C组血 TNF一a水平(P0.05);而B、D组治疗过程中各时间 点血浆TNF一a水平未见明显变化(P .05)。A组的 平均生存时间为110.25士18.69h，明显长于其余三组。 IF文 南京医科人学博}丫一位论文 永生化细胞构建实验中，RT一PCR方法成功从293 细胞扩增出ad5E IA基因。经双酶切与载体连接后， 测序结果证明重组质粒构建成功。随后应用 Lipofectamine转染成功筛选出阳性克隆，能持续生长 并稳定传代30代以上。RT一PCR证实ad5EIA基因在 转化后细胞的表达，免疫荧光证明了ad5EIA蛋白的 表达。MTT测定结果显示ad5EIA表达的人近曲小管 上皮细胞与对照组细胞相比，生长速率明显增快 (P0.05)。流式细胞仪结果显示转化后细胞GO/Gl 期比例较对照组明显减少(P0.05)。转化后细胞的 AKP、NAG、钠钾ATP酶活性均高于HKZ细胞株 (P0 .05) 结论 采用LLC一PKI细胞株作为细胞来源构建的RAD 具有理想的体外选择性重吸收功能，其功能在5小时 内能稳定维持，证明本实验中所采用的更为简便的方 法构建RAD具有可行性。 用RAD治疗改善了MODS/MOF的生命指标(如 MAP)和肾功能(SC:)，并使血中IL一10升高、TNF一a 下降，进而延长了动物生存时间。 利用ad5EIA基因转化原代培养人肾近曲小管上 皮细胞具有可行性，转化后的细胞具有永生化特征， 其部分功能优于HKZ细胞株，为今后进一步的RAD 优化研究打下基础。

【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R692.5