CTGF在介导肾脏肥大中的作用——体内外实验研究

【摘要】：目的：肾脏肥大是多种肾脏疾病(如糖尿病肾病和残余肾)早期重要的病理表现，与肾脏疾病的预后可能有密切关系。最近的研究表明，肾脏局部肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system，RAS)激活在肾脏疾病慢性进展中起十分关键的作用，但是其详细作用机制仍是学术界研究的热点问题。晚近研究提示，血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)是导致肾脏肥大的一个重要调节因子，但是其确切机制仍不明了。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)是新近发现的一个重要的致纤维化因子，在以增殖性病变为主的肾脏疾病中表达增高。CTGF是否介导AngⅡ所诱导的肾脏肥大?其可能的机制是什么?这些问题国内外尚未见研究报道。本研究主要通过体外细胞培养和肾脏肥大动物模型--链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)诱导单肾切除大鼠，探讨CTGF在介导肾脏肥大形成中的可能作用及其作用机制。 方法：人近端肾小管上皮细胞株(human proximal tubular cell line，HPTCL)HK-2用含10％胎牛血清(fetal calf serum，FCS)的低糖型Dulbeccos's Modified Eagle's Medium(DMEM)培养液培养。无血清培养24小时后，用AngⅡ(10~(-7)mol·L~(-1))干预细胞，采用RT-PCR和Western blot技术观察0-72h CTGF mRNA和蛋白质表达时间效应关系；观察不同浓度AngⅡ(0-10~(-5)mol·L~(-1))作用细胞48h后，HK-2 南京医科大学博士学位论文 细胞CTGF mRNA和蛋白质表达的浓度效应关系。用抗CTGF抗体 干预Angll(10一7mol·L一’)处理的细胞，分另!」观察其对细胞蛋白质 从头合成(!’H卜leucine掺入实验)、细胞内总蛋白含量(考马斯 亮蓝蛋白定量技术)、细胞大小(扫描电镜技术)的影响;抗CTGF 抗体对Ang川10一7mol·L一’)诱导的细胞周期分布的影响(流式细 胞分析技术);运用RT-PCR技术和细胞免疫化学技术检测抗CTGF 杭体对Angll诱导的细胞p27kip 1 mRNA及蛋白表达的影响，以及 抗CTGF抗体对Fibroneetin(FN)mRNA表达的影响。我们还采用 CTGF一反义寡核普酸(CTGF一AS)干预分另!J观察了其对HKZ细胞蛋 白合成、细胞周期、细胞超微结构及形态改变、细胞表达a平滑肌 肌动蛋白(a一smooth muscle aetin，。一SMA)改变的影响。在体实验 中，我们采用一次性腹腔注射STZ建立单肾切除的SD大鼠糖尿 病肾脏肥大模型。实验分三组，即:对照组(Control，GroupC); 糖尿病肾病组(diabetic nephropathy，DN，Group DN):糖尿病肾病 并采用血管紧张素11受体l桔抗剂一厄贝沙坦(i rbesartan，Irb)干 预组(Group DNx)。实验动物分另，J在模型建立后第1、2、4、8周 处死，取血、尿、’肾组织标本检查，观察血糖、’肾功能、尿蛋白定 量(24h uPro)、尿白蛋白排泄(24hualb)改变。形态学检测包括 肾脏重量、’肾重指数(KW/BW)、计算机辅助图象分析肾小球毛细 血管拌面积(AG)、肾小球体积(VG)、’牙小管面积(AT)、以及 电镜观察肾小球毛细血管基底膜、肾刁、管上皮细胞基底膜厚度改变 等。免疫组化观察肾脏cTGF、P27kiPI、。一sMA表达的动态变化， 南京医科大学博士学位论文 并做CTGF表达与p27kipl、。一sMA表达、AG、VG、AT等指标的 相关分析等。 结果:Angll呈浓度和时间依赖性刺激cTGF mRNA和蛋白的表达， 用Angl一(一。一7mol·L一‘)作用细胞。一72h，1 Zh时eTGFm洲A表达 即显著增高(尸0.01)，24h蛋白表达明显增高;不同浓度的Angll (o一10一smol·L一，)作用细胞4sh，在10一gmol·L一’时eTGF mRNA 表达增高，10一smol·L一，时蛋白表达最明显。用10一7mol·L一’Angll 作用于细胞48h，细胞「3H]一leucine掺入量、细胞内总蛋白含量、细 胞平均直径明显增加，这些作用可被抗CTGF抗体显著抑制;流式 细胞分析技术显示用10一7mol·L一’Angll未}j激细胞48小时，细胞大 部分阻滞在GO一GI期，抗CTGF抗体可以显著抑制细胞周期阻滞现 象。Angll呈浓度和时间依赖性刺激p27kiPI和FN mRNA表达， p27kip 1 mRNA的表达48h达高峰，fN;nRNA表达贝，J持续升高，杭 CTGF抗体可以显著才印制Angll诱导的HKZ细胞p27kipl、FN表达。 采用cTGF一As干预Angll诱导的HKZ细胞上述效应，结果表明， CTGF一AS可以显著抑制AngH诱导的HKZ细胞CTGF mRNA和蛋 白表达(尸分别0.01); CTGF一As还可以显著抑制Angll诱导的HKZ 细胞总蛋白含量的增加(尸分另.J0.05，0.01)，且呈浓度和时间依赖 性。对细胞周期分析显示，cTGF一As能显著抑制Angll所致的细胞 周期阻滞在Go一Gl期。采用相差显微镜及扫描电镜观察显示，Angll 导致细胞体积显著增大、变形，而CTGF一AS可以显著抑制细胞的 南京医科大学博士学位论文 这种形态改变。透射电镜观察显示，Angll诱导细胞肥大，细胞表 面微绒毛减少，细胞内粗面内质网增多、线粒体减少、高尔基器增 加等，而CTGF一AS干预组可见细胞体积减小，细胞内线粒体增多、 内质网减少等。我们进一步观察Angll对HKZ细胞a一SMA表达的 影响，发现随着Angll作用时间的延长，?

【关键词】：人近端肾小管上皮细胞 血管紧张素Ⅱ 结缔组织生长因子 肥大 链脲佐菌素 糖尿病 大鼠 p27kip1 免疫组化
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R692
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