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马鞭草提取液对体外培养人早孕蜕膜细胞的影响

张曙萱  
【摘要】:前言 计划生育是我国的一项基本国策,抗生育药物的研制则是计划生育工作的重要组成部分。目前临床抗生育药物主要是甾体合成药,作用位点高且多系抗排卵药物,对机体内分泌有一定的干扰。而中草药则具有特有的天然疗效,作用位点低,副作用小等特点;对马鞭草有效部位进行提取分离,筛选出其抗生育的有效组分或有效成分,对于开发新型计划生育药物具有非常重要的意义。 蜕膜是孕卵着床和胚胎发育所必须的组织,用药物干扰蜕膜的发育应是理想的抗早孕手段。体外细胞培养以其直观、便利展现了其独特的优越性。马鞭草有破血通经、利尿消肿等作用,孕妇忌用。我院曾对76例停经33-42天健康早孕妇女口服马鞭草粉剂,流产成功率达83.4%。孕早期人绒毛组织体外培养显示,马鞭草能明显抑制绒毛生长及滋养层细胞分泌HCG的功能;动物实验表明,马鞭草也能明显抑制胚胎生长而使其固缩死亡,破坏滋养层细胞,对小鼠有明显的抗旱孕作用。但对马鞭草是否能抑制蜕膜细胞的生长还不甚清楚,以及对于马鞭草终止早孕的有效部位的确定国内也尚未有报道。 中药抗生育效果良好,副作用小;服用方便,已成为各国当前日益关注的课题。目前,应用中草药抗孕方面的研究虽然有些报道,但缺乏基础细胞等方面深入的研究。 南京人学硕上学位沦文 本研究目的首先是进行蜕膜基质细胞的体外培养,并对其培养 方法做了一定的改进,然后观察经不同提取途径获得的马鞭草提取液 A、B、C、D及米非司酮对蜕膜细胞形态,增殖,细胞凋亡及细胞周 期动力学的影响。从而了解马鞭草抗生育的机制及有效抗生育作用组 分及作用位点。 第一部分 人类蜕膜基质细胞体外培养的研究 目的: 建立良好的人类蜕膜机质细胞培养方法。 方法: 实验选用早孕人工流产蜕膜组织进行体外培养,配制FD完全培 养液及0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)消化液,进行全组分蜕膜 细胞培养,24小时后换液,清除未贴壁的蜕膜细胞及红细胞。视细 胞生长情况,2饱天换培养液一次。待细胞融合达800/011寸,用0.25% 胰蛋白酶与0.OZEDTA(1:1)消化贴壁细胞,传代。矛,」用传三代的方 法对蜕膜基质细胞进行分离提纯。传三代时部分细胞用盖片法培养, 制作细胞爬片,用泌乳素(prolaCtin PRL)免疫组化试剂盒检测培 养细胞成分,鉴定细胞纯度。 结果二 人体蜕膜基质细胞悬浮时呈典型的卵圆形,单层培养时为纤维母 细胞状。接种后30分钟开始贴壁,逐渐伸长成为纤维母细胞状,呈 南京大学硕卜学位论文 较长的梭形和不规贝!}星形,核呈卵圆形,位于细胞中央,核仁清晰, 有丰富的胞质颗粒。24小时细胞大多贴壁,6一了天可贴壁汇合。原代 培养的蜕膜细胞在20cy0FCS的培养液中可增生数周,直至细胞汇合后 才保持不变。其中约750/0为蜕膜基质细胞,细胞之间相互连接,胞间 界限模糊。传代后的蜕膜细胞生长迅速,2一3天即可铺满瓶底,镜下 细胞形态均一,呈梭形或不规则星形。传三代后其形态无明显变化, 而传代培养极性渐不明显。免疫组化显示体外培养传代后97ry0蜕膜细 胞为蜕膜基质细胞。 结论: 该实验方法经济实用、简单,简化了蜕膜细胞的提纯程序,获得 的蜕膜基质细胞纯度高。 第二部分 马鞭草提取液及米非司酮对体外培养人早孕蜕膜细胞的的影 响 目的: l.探讨马鞭草及米非司酮抗早孕的细胞学作用机理; 2.初步确定马鞭草杭生育的有效部位。 方法: 1.取正常妊振6一9周妇女人工流产的蜕膜组织,进行体外细胞培 养,传三代后接种于培养瓶中。培养24小时后,换液,分为含 25mg/ml(含马鞭草生药)的A、B、C、D组(A、B、C、D分别为马鞭 南京大学硕士学位论文 草石油醚、氯仿、乙酸乙醋、甲醇提取液,每毫升含生药1克)及 SOug/nll的米非司酮组及未加药组。继续培养48,J、时,在倒置显微 镜下观察。 2.将传三代后的蜕膜基质细胞接种与三块%孔培养板,设三复 孔。24,J、时后对照组加入培养液20Oul,加药组分另,{加含A、B、C、 D及米非司酮培养液ZO0ul,A、B、C、D的终浓度为12.5 mg/ml,25mg/ml,50mg/ml(含马鞭草生药).米非司酮的终浓度为80 ug/ml。加药后分另,J继续培养24,J、时,48,J、时,72,J、时。MTT显色 法测各孔的吸光度0D值。 3.培养蜕膜基质细胞,传三代后接种于培养瓶中(共30瓶,平分 为6组)。培养24,J、时后,分为加入25mg/ml(含马鞭草生药)的A、B、 C、D及25mg/ml的米非司酮组及未加药组。继续培养48小时后 FACScan流式细胞仪测定荧光强度。对细胞凋亡及细胞周期动力学进 行分析。 结果: 1.高于12.smg/ml的A、B、C及80ug/ml的米非司同酮均可明显 改变蜕膜基质细胞的形态,使细胞数明显减少,细胞体积缩小,漂浮 细胞较多,细胞变圆,缩小,细胞固缩,空泡化,有的细胞破碎。D 药无明显作用。 2.MTT显色法示A、B、C及米非司酮组对细胞生长有明显的抑制 作用,并呈剂量依赖性抑制。在一定的范围内,有良好的量效关系。 D药无明显作用。 3.25。lg/ml的A、B、C及米非司酮(8 Oug/ml)均促进细胞凋亡, A、B、C组蜕膜细


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