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《南京医科大学》 2004年
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大鼠胚胎胰腺巢蛋白的表达及早期胚胎胰腺显微分离方法的建立

倪雪峰  
【摘要】:干细胞是一类具有自我复制增殖和高度分化潜能的未分化细胞,按分化潜能干细胞分为全能性、多能性、单能性干细胞。按发育阶段分为胚胎干细胞,组织干细胞。胚胎干细胞是从囊胚期的内细胞团中分离出来的。具有多能性,即可分化为所有种类细胞的能力;成年干细胞具有多能性,在体外具有分化为多种成熟细胞的能力;另外,干细胞具有在体外无限增殖的特点,这为保证组织工程学所需要细胞在数量上提供了保证。 干细胞研究的关键步骤包括干细胞的筛选和体外定向诱导分化。干细胞的筛选依据是干细胞表面的标志和特异性的基因和转录因子的表达,是干细胞研究的第一步。目前胰腺干细胞的标志物主要包括巢蛋白、Pdx1、ngn3等,其中巢蛋白是应用最多的筛选指标。 为了研究巢蛋白在内分泌胰腺的发展的表达,我们选择了三个内分泌胰腺发育的生物学的重要阶段,胚胎18.5天、新生期、成年期,研究此三时期胰腺原因如下:(1)从三时期胰腺的HE、组化照片来看,在E18.5天,胰岛已形成典型的形态结构,胰岛体积较新生、成年小,胰岛素阳性,着色浅,形态刚刚成熟,有insulin合成功能,处于功能前期状态。此时的胰岛尚需要进一步的分化成熟。(2)新生 南京医科人学硕卜学位论文 期胰腺的胰岛体积、胰岛素着色介与18.5天与成年间,内外分泌部 分均已经分化成熟,脱离母体开始接受外界的刺激,行使生物学内外 分泌功能,作为生理过渡时期,处于功能初期,还要进一步完善。(3)、 成年期的胰腺,胰岛体积大,单位视野内的胰岛数少,胰岛素着色最 深,此时的内外分泌处于分化成熟阶段。三个时期代表胰腺发育过程 中的功能前期、功能期和功能成熟期。通过研究胰腺千细胞的标志蛋 白一一巢蛋白随着胰腺的功能发育和完善过程中的表达、分布情况。 了解巢蛋白在胚胎发育过程中有何趋势,为探索胰腺日细胞的生长发 育的调控提供客观的理论依据。 本课题通过RT一PCR和免疫组化方法,从核酸和蛋白水平着手, 经过相应的统计分析,我们首次证明,巢蛋白在18.5天、新生期、 成年期。在胰腺后期功能完善过程中,胰腺内均有巢蛋白的表达,主 要定位在胰岛和导管,在核酸和蛋白水平表达呈下降趋势。统计显示 胰岛内的巢蛋白阳性细胞的百分比也呈下降趋势。提示胚胎18.5天 的胰腺干细胞多于新生、成年阶段。胚胎后期取材的胰腺干细胞未见 报道,这方面研究很值得进一步深入研究。 在18.5天,胰岛结构的基本成型,但功能不完善,随着发育, 主要需要进行功能的完善。胰腺的增生分化功能渐减弱,只需要保持 一定的增殖,及维持体内正常的细胞凋亡,尤其是在成年阶段。巢蛋 白在从18 .5天至成年时期表达呈现逐渐下降趋势,一方面推测胰腺 内的千细胞逐步减少,另一方面巢蛋白的下调或许对胰腺的功能完善 有一定的促进作用。 南京医科人学硕卜学位论文 在同一阶段,巢蛋白在胰腺的胰岛导管内均有分布,说明干细胞 的分布不是局限的,同时提示细胞在分化过程中存在着细胞的迁移。 而细胞外信号的复杂的相互作作用和反应性的遗传网络,控制内分泌 细胞的生长和分化还未研究。还不知道nestin表达如何被调控,以 及ne 5 t in阳性细胞怎样被诱导分化为内外分泌细胞。 胰腺中的ne 5 t in阳性细胞与周围胃肠组织中的nestin阳性细 胞,起源调控、分化特性是否一致,有何异同,值得深入探讨。 为了深入研究早期胚胎胰腺的生长发育调控过程,及进一步研究 早期胰腺干细胞的研究,本实验通过不断摸索,掌握了SD大鼠胚胎 12.5天、15.5天、18.5天的胰腺的显微取材方法,并予以HE染色 鉴定。此方面的实验研究国内未见相关报道。取材的成功为课题的深 入莫定了物质基石出。 从取材显微照片来观察,早期胚胎胰腺的发育非常迅速,这从取 材照片中可以观察到。首先,根据比例尺显示,12.5天的胚胎胰腺 体积小,根据显微标尺显示,只有0.4mm。更重要的是结构上与15.5 天的胚胎胰腺相比,更单一,从照片上可以看到背侧胰腺是一个圆球 形,中间有较透明的上皮,周围是间充质,与国外的取材文献报道一 致;而15 .5天的胚胎胰腺从外形上看与18 .5天的胰腺相似,只是大 小差异。胚胎18.5天至新生阶段胰腺体积增加教前更迅速,胰岛数 也大大增加,但形态无明显差异。结合文献报道,可看出1 2.5天至 15 .5天胰腺处于高速发展时期,处于质的飞跃阶段。这一阶段的胰 腺发育调控非常有意义。值得深入的实验研究。对于揭示胰腺的发育 南京医科大学子吹1学位论文 调控机制有重要的意义。 转化生长因子(TGF)在多种哺乳动物组织细胞中具有影响细胞 的生长、增殖、分化作用。在胰腺发育初期,TGF信号对原肠上皮特 化为胰腺上皮起着重要作用;在胰腺分化过程中抑止外分泌细胞、促 进内分泌细胞;对内分泌细胞迁徒,进入间充质细胞最终形成胰岛也 起着关健作用。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R321

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【参考文献】
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