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《南京医科大学》 2006年
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基因芯片联合组织芯片探讨原发性肝癌发生发展的分子机制

刘秀峰  
【摘要】:制全貌,为临床诊治提供新的潜在靶点。 材料与方法:1、收集10例施行正位肝移植的HCC患者的癌、癌旁和正常肝组织,应用HE染色确认相关组织的病理类型,应用Trizol一步法抽提配对组织的总RNA;2、应用1%琼脂糖凝胶电泳和芯片实验室(Lab-on-chip)进行RNA质量检测;3、按QIAGENRNeasy(?) Mini Kit说明,进行总RNA纯化、逆转录cRNA合成、荧光标记和纯化;4、将癌组织和正常肝组织、癌组织和癌旁肝组织的cRNA探针分别与Agilent寡核苷酸芯片(21,073探针)进行杂交,洗涤后应用Aailent Scanner获取图像,应用Feature Extraction软件进行定量分析处理,应用cluster分析软件进行聚类分析,通过Treeview软件以树状图形式显示;5、挑选明显差异表达的代表基因4个,其中包括上调和下调基因各2个,以β-actin为内对照基因,由上海生工生物公司设计合成目的基因引物前导链和后随链,按Invitrogen RT-PCR kit说明进行SYBR Green Ⅰ染料掺入的荧光real time RT-PCR绝对定量验证分析;6、挑选差异表达的代表基因6个,其中包括5个上调基因和1个下调基因,在高通量肝癌特异性组织芯片(产品批号:OD-CT-DgLiv01-001)上应用S-P法验证代表基因在蛋白水平的表达,采用SPSS10.0软件包分析相关基因的表达与HCC临床病理参数之间以及基因相互之间的相关性。 结果:1、HE染色结果显示癌、癌旁以及正常肝组织呈现典型的组织病理变化,1%琼脂糖凝胶电泳和Lab-on-chip电泳结果均提示提示配对组织总RNA的质量高,无降解现象。2、高通量Agilent寡核苷酸芯片扫描发现在癌和癌旁组织的差异基因表达谱中,2倍上调的的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)共1295个,而癌与正常肝组织的数目为1074个,综合两者的共同DEGs,共420个;相应的,在癌和癌旁组织2倍下调的DEGs共1320个,而癌与正常肝组织的数目为1107个,共同下调的DEGs为552个。3、Cluster聚类分析显示HCC的发生发展过程涉及癌基因与抑癌基因、编码离子通道和蛋白转运相关的基因、编码细胞周期相关蛋白的基因、与细胞应激相关的基因、细胞骨架和运动相关的基因、细胞凋亡相关的基因、调节DNA合成、修复和重排相关的基因、细胞因子受体相关基因、免疫蛋白相关基因、细胞代谢相关基因、信号转导相关基因、调节转录的基因、与生长发育相关的基因等,尚有部分基因不能分类或为表达序列标签(expression sequence tags,ESTs)。4、差异基因表达谱中,包含12个5倍以上上调表达的基因,分别是CTHRC1、UCHL1、PPP1R9A、CTSL2、POSTN、NQO1、DKK1、AGR2、MMP-12、SULT1C1、LAPTM4B和PEG10;7个10倍以上下调表达的基因,分别是3个细胞色素P450基因(CYP2C9、CYP2A7和CYP2C8)、
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R735.7

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【参考文献】
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