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《南京医科大学》 2007年
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同种异基因骨髓间充质干细胞诱导大鼠肾移植免疫低反应性的实验研究

张炜  
【摘要】: 第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离、培养与鉴定 目的:建立稳定的大鼠间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)体外分离、培养、鉴定方法,为进一步开展细胞移植提供细胞来源。 方法:选用雄性清洁级Wistar大鼠,月龄1月,处死消毒后取其长骨,用含15%胎牛血清L-DMEM冲洗骨髓腔,收集冲洗液,采用密度梯度离心法分离获取细胞,培养后取贴壁细胞进行传代培养。取第3代生长状态良好的细胞,胰蛋白酶消化制成细胞悬液计数并记录生长曲线。细胞悬液加入二甲亚砜和胎牛血清培养基以冻存。在骨向诱导条件下:加入地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸后,进行培养15天后碱性磷酸酶(ALP)染色。在成脂诱导条件下:加入青霉素、链霉素、转铁蛋白、胰岛素、亚油酸、地塞米松、3-异丁基-1甲基黄嘌呤,培养5天后,改用加入快速胰岛素而无胎牛血清培养基培养5天,予油红O染色。 结果:MSC分离后在培养瓶中24h后就有细胞贴壁,全量换液去除未贴壁细胞,第3-4d细胞生长明显,传代后细胞生长迅速约5-6d即可长满培养瓶底,达融合状态。三代后即可得到较为纯化的MSC成纤维样细胞,并至少可传至10代以上,冻存对细胞生长无明显影响。在脂肪细胞诱导分化过程中可以观察到诱导后第二天即有含脂质的空泡在细胞内累积,至4-5天脂质含量更为丰富。在骨细胞分化中,MScs形成聚集物或小结,并增加碱性磷酸酶的表达,3天后出现明显的钙沉积。经染色证实诱导均获成功。 结论:1)MSC是一种能够自我更新,至少能够体外传代达到10代,有很强增殖能力的干细胞,并在一定条件下,可向多种细胞分化,具有多向分化特性;2)以约200/cm~2密度接种,采用0.25%胰酶消化5 min对于Wistar大鼠MSCs的生长及消化传代效果较好;3)通过密度梯度离心及贴壁筛选培养法获取大鼠MSC的方法简便易行,可提供稳定的大鼠MSC。 意义:研究证实了MSC具有很强增殖能力、多向分化潜能,获取方法简便易行,为进一步开展细胞移植治疗提供了细胞来源。 第二部分大鼠肾移植模型的改良 目的:以改良方法建立成功率较高的大鼠肾移植模型。 方法:Wistar大鼠作为肾移植供体,Lewis大鼠作为受体,采用重力低温原位灌注对供体的左肾灌注,受体左肾切除后行供受体腹主动脉-腹主动脉两定点端侧吻合,肾静脉-肾静脉间断端端吻合,输尿管膀胱瓣与受体膀胱吻合。术后第2天使用术中预留线结扎右肾动脉,替代右肾切除以减轻受体手术打击,提高手术成功率。 结果:预试验中共施行大鼠肾移植30次60X(30对),成活21只,供体、受体手术时间分别为50±14、75±22min,热缺血时间1min左右,冷缺血时间为60±11min,手术时间共为140±30 min,并发症依次有吻合口出血、排斥反应、肾衰、感染、血栓形成、输尿管梗阻等,成功率70%。正式试验时,作者施行大鼠肾移植36次72只(36对),成活34只,供体、受体手术时间分别为35±12、65±10min,热缺血时间1min左右,冷缺血时间为40±8min,手术时间共为110±20 min,成功率约95%,其中一只是由于肾静脉吻合口出血而导致失败,另一只为净动脉血栓形成。 结论:本模型建立的改良为重力原位恒压灌注;原位修整供肾,取肾、移植肾均在左侧;动、静脉均采取直接吻合法;采用输尿管带膀胱瓣吻合法;延迟肾切除。整个手术均在显微镜下进行,手术难度较大,但效果较好。 意义:通过手术方面的改进,成功地改良了大鼠肾移植模型,并使手术所带来的对采用该模型进一步实验的影响减至最小。 第三部分MSCs移植免疫调节作用及与CsA协同作用的研究 目的:观察大鼠MSCs对大鼠移植肾的影响,了解MSCs的免疫调节,探讨使用MSCs减少免疫抑制剂环孢素A(Cyclosporine A,CsA)剂量甚至诱导免疫耐受的可能性。 方法:将实验动物随机分为4组进行肾移植,分别接受不同的预处理和术后治疗。(1)MSC诱导组(第1组):受者于肾移植前1周、开放血流前、术后1周、2周分别输注来源于Wistar大鼠的MSC1×10~7,术后无特殊药物治疗;(2)CsA治疗组(第2组):受者不接受预处理,术后每日腹腔内注射CsA0.5mg/kg;(3)MSC诱导+常规剂量CsA组(第3组):受者接受MSC诱导方法同单纯MSC诱导组,并术后每日给予CsA0.5mg/kg;(4)阴性对照组(第4组):受者不接受任何预处理,肾移植术后腹腔内注射PBS作为对照。术后于第3、5、10、15、25、40天取血测定各组血肌酐值,于术后第4天各组取2只大鼠肾脏病理,RT-PcR分析大鼠肾脏IL-1β,TNF-α,TGF-β1等相关炎性因子产生情况,观察其余大鼠生存时间。 结果:CsA治疗组(第2组)或联合疗法组(第3组),与阴性对照组(第4组)相比,显著延长动物存活期(P=0.002,0.003)。与阴性对照组相比,MSC诱导组(第1组)存活期确实有所延长(P=0.001),但比第2组(P=0.036)及第3组(P=0.045)要短。阴性对照组的SCr与第1、2、3组相比,从第5天开始显著升高(P=0.000,0.011,0.000),第2组与第1以及第3组相比第5天出现SCr的升高(P<0.05),但三组间在其余几天检测上没有显著差异。病理研究发现第4组移植肾出现了典型的严重急性排斥,第1组表现出明显减轻的急性排斥,第2及第3组与第1组相比,又有明显改善。包括IL-1β,TNF-α及TGF-β1在内的所有炎症介质的mRNA产物,第2组结果与其余各组相比明显要少(P<0.01),第1组与第3组在某些炎症介质的产物上也有轻度减少。 小结:MSCs能够对免疫反应产生下调作用,减少部分炎症介质的产生,在移植后初期保护移植器官的功能并延长动物的存活期。但这种作用弱于CsA疗法。此外,MSCs联合小剂量CsA疗法,能保护移植器官的功能,但与CsA单一疗法相比并不延长动物的存活期。 意义:本研究中,MSCs在体内免疫下调作用有限,且可能与CsA在体内存在相互影响,影响免疫抑制效果。因此,主张通过应用MSCs以减少CsA剂量的观点需要进一步研究。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R699

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