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《南京医科大学》 2007年
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转化生长因子β1-Smad信号转导通路在肝细胞性肝癌发生发展中的作用机制研究

季国忠  
【摘要】: 转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族是由一类结构和功能相关的多肽生长因子亚家族组成,包括TGF-βs、激活素、抑制素、骨形态发生蛋白等。广泛存在于多种生物的各种组织中,参与细胞增殖分化、胚胎发生、血管形成、肿瘤发生、细胞外基质形成、骨骼形成与重建等多种生物学事件。TGF-β作用于效应细胞的信号转导主要通过激活Smad通路实现。近年来,TGF-β1-Smad信号通路在恶性肿瘤中的研究是肿瘤信号转导领域的一大热点。Smad4是TGF-β1-Smad通路信号转导的中枢环节,哺乳动物Smad4最初在胰腺癌的研究中被发现,也被称为DPC4(deleted in pancreatic carcinoma locus 4),其缺失和突变率高达50%,已有研究显示Smad4扮演抑癌基因的作用。目前对TGF-β1-Smad4在胰腺癌中的作用已做了较为深入的探讨,但是在肝癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤中的研究仍较少,而且对于肝癌,包括我们已有研究在内的国内外不少研究结果差别较大,有的甚至相反。另外,该通路下游基因的调控情况尚不完全清楚,而Smad4非依赖通路的存在和多条通路间复杂的相互作用现象更是为癌症发生机制增添了无限的神秘。信号通路上各点或各因子之间的关系,如同浩瀚宇宙中各天体之间的关系一样,非常复杂,使这种我们暂且称之为“微天体”之间关系(relationship between microheavenly bodies)的研究较为艰难。 为了探讨TGF-β1-Smad信号转导通路在肝细胞性肝癌(HCC)发生发展中的作用及机制,本课题在临床病理研究的基础上,利用Smad4在TGF-β1-Smad通路中处于中枢环节的机制,通过RNA干扰技术沉默其表达,观察对细胞生物学特性的影响及信号转导通路中其他相关基因的变化,这些结果将为阐明肝细胞癌中TGF-β1-Smad信号转导途径的功能提供重要的理论依据,并可能为肝细胞癌的生物学治疗提供新的靶点。 目的 探讨TGF-β1-Smad信号转导通路在肝细胞性肝癌形成中的作用及其可能机制。为进一步深入了解肝细胞癌的发生、发展过程并为其分子诊断和基因治疗提供新的科学依据。 方法 (1)利用免疫组化技术,分别检测36例肝癌组织和癌旁肝组织中TGF-β1、转化生长因子βⅡ型受体(TβR-Ⅱ)、核转录因子κB(NF-κB)、Smad4及Smad7蛋白的表达;观察TGF-β1和TβR-Ⅱ、NF-κB、Smad4及Smad7蛋白表达之间的关系。另外,鉴于Smad4在TGF-β1-Smad信号通路中处于的中枢地位,为确证肝癌组织中Smad4的表达,有利于后续研究,我们进一步提取了患者肝癌组织和癌旁组织的总RNA与总蛋白,以及正常肝细胞系L02和肝癌细胞系SMMC-7721的总RNA与总蛋白,体外进行RT-PCR和Western blot分析Smad4基因的表达。 (2)利用RNA干扰(RNAi)技术,构建Smad4 RNAi真核表达载体:即针对Smad4基因,设计、合成3对编码发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,退火后分别将其克隆入pGCsi-H1/Neo/GFP质粒,酶切、测序鉴定。脂质体法转染293工具细胞。72小时后实时荧光定量PCR检测Smad4基因表达的特异性抑制效率。 (3)根据已筛选确定的Smad4基因RNAi有效靶序列,合成相应shRNA的寡核苷酸序列,退火形成双链DNA,与经Mlu I和Cla I酶切后的pLVTHM载体(含H1启动子和绿色荧光蛋白GFP)连接产生Smad4 RNAi慢病毒载体LT32,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用LT32、pCMV-dR8.74和pMD2G三质粒共转染293T包装细胞,包装产生慢病毒,根据293T细胞中GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。再以包装产生的慢病毒颗粒感染肝癌SMMC-7721目的细胞,通过检测GFP的表达确定感染效率。 (4)为了进一步探讨Smad4基因沉默对TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞生物学性状的影响,将SMMC-7721细胞分为对照组(简称CTL组)、转染Smad4 RNAi相应阴性对照病毒载体组(简称LTN组)和转染Smad4 RNAi病毒载体组(简称LT32组),分别用100 ng/ml TGF-β1进行处理后进行以下检测:①以台盼兰排斥法进行活细胞计数绘制的细胞生长曲线和MTT检测结果评价细胞增殖情况;②通过PI染色与TUNEL染色法检测细胞凋亡的发生情况;③SMMC-7721细胞体外侵袭能力的测定在Transwell小室中进行;④利用RT-PCR与Western blot分别检测与细胞增殖、凋亡及侵袭能力相关的基因表达,包括p16、p21、p53、caspase 3、MMP-2、MMP-9及VEGF等,以探讨这些基因与TGF-β1-Smad通路在信号转导过程中的关系。 结果 (1)临床病理观察:肝癌组织TGF-β1和Smad7表达明显高于癌旁组织;但TβR-Ⅱ和Smad4表达明显低于癌旁组织。肝癌组织中NF-κB和TGF-β1的表达呈高度一致性。这些结果表明:在肝癌组织中,TGF-β1-Smad信号转导通路上主要因子TGF-β1、TβR-Ⅱ、NF-κB、Smad4及Smad7蛋白表达均有异常,提示它们可能在肝细胞癌的形成中发挥重要作用;肝癌组织中TGF-β1抑制作用的减弱可能是由于TGF-β1-Smad信号转导通路上TGF-β1的受体(如TβR-Ⅱ)和受体后因子(如Smad4和Smad7)异常所致;NF-κB可能在介导TGF-β1的活化或产生中发挥一定的作用。另外,对患者肝癌组织和癌旁组织以及正常肝细胞系L02和肝癌细胞系SMMC-7721中Smad4的表达分析显示肝癌组织与相关细胞系中Smad4基因mRNA与蛋白的表达均低于癌旁组织与正常肝细胞系,进一步证实Smad4基因表达的下调在肝细胞性肝癌的发生中可能发挥重要的作用。 (2) Smad4 RNA干扰靶序列的设计与表达载体的构建:针对Smad4基因(NCBI:NM_005359)的shRNA序列设计采用Ambion公司的网上设计软件进行(www.ambion.com),并blast比较分析,排除可能的偏靶效应。在筛选出3条特异性序列后,根据所选择的shRNA序列合成两条相应的DNA寡核苷酸,退火形成双链DNA后将其接入pGCsi-H1/Neo/GFP质粒进行重组转化。重组后载体分别利用HindⅢ和BamHⅠ双酶切进行鉴定,并且DNA测序进一步证实小干扰RNA(siRNA)序列正确并被准确克隆入pGCsi-H1/Neo/GFP载体。脂质体法进一步将载体转染293工具细胞,72小时后,实时荧光定量PCR检测结果表明3种重组载体psiSmad4-1、psiSmad4-2和psiSmad4-3分别对293细胞中Smad4基因mRNA表达的特异性抑制率为39.0%、8.8%和73.8%,表明质粒介导的RNAi能够抑制Smad4基因的表达,其中以psiSmad4-3的抑制效率最高,Smad4基因shRNA表达载体成功构建。 (3) Smad4 RNAi病毒载体的构建与病毒包装纯化:将已验证有效的Smad4 RNAi靶序列3进一步克隆到病毒表达载体中。在合成Oligo DNA后,经体外退火形成双链DNA。然后与经Mlu I和Cla I酶切后的pLVTHM载体进行连接转化。PCR和测序证实Smad4 shRNA寡核苷酸链序列正确插入病毒表达载体中。进一步包装慢病毒,感染目的细胞。实验结果显示病毒载体对SMMC-7721细胞的感染效率在85%以上,此时Smad4蛋白表达的抑制效率达60%,表明Smad4基因shRNA慢病毒载体成功构建。 (4) Smad4基因沉默对TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞增殖抑制作用影响:利用细胞计数法绘制细胞生长曲线和MTT检测法评价肝癌SMMC-7721细胞的生长情况。SMMC-7721细胞在TGF-β1的诱导下,细胞生长速度减慢,出现了明显的增殖抑制现象;转染Smad4 RNAi相应的阴性对照病毒载体LTN,对SMMC-7721细胞的增殖没有明显影响,并且对TGF-β1诱导的细胞增殖抑制效应也未产生明显影响;而当细胞转染Smad4 RNAi病毒载体LT32后,TGF-β1诱导细胞增殖抑制作用被显著削弱,提示TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞增殖抑制作用受Smad4表达的影响,其信号转导为Smad4基因依赖性的。另外,我们还发现在转染阴性对照病毒载体LTN对SMMC-7721细胞的增殖没有明显影响的情况下,转染Smad4 RNAi病毒载体LT32却引起SMMC-7721细胞生长减慢,提示下调Smad4的表达能够抑制SMMC-7721细胞的增殖。 (5)TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞增殖抑制过程中p16与p21的表达变化:p16与p21为重要的细胞周期调控基因,在细胞周期调控中阻止细胞由G_1期进入S期,防止细胞过度增殖。因此,我们进一步检测了在TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞增殖抑制过程中p16与p21基因的作用及其与TGF-β1-Smad通路的关系。结果显示,TGF-β1处理肝癌SMMC-7721细胞36小时,p16的表达出现明显上调,增加了近55%;转染Smad4 RNAi相应的阴性对照病毒载体LTN,对SMMC-7721细胞中p16的表达没有影响,且对TGF-β1诱导p16表达的上调也未产生明显影响;SMMC-7721细胞转染Smad4 RNAi病毒载体LT32后,虽未对p16的表达产生影响,但TGF-β1诱导的p16表达的上调则几乎被完全抑制,表明TGF-β1诱导的SMMC-7721细胞生长抑制作用与p16的表达上调有关,p16可能作为Smad4的下游调控基因,与Smad4一起参与了TGF-β1的信号转导过程。而对于SMMC-7721细胞,无论是利用TGF-β1进行诱导,还是沉默Smad4基因,p21的表达均未发生明显变化,表明在TGF-β1诱导SMMC-7721细胞生长抑制的信号转导过程中p21可能并未作为Smad4的下游靶基因发挥重要作用。 (6) Smad4基因沉默对TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡作用的影响:利用PI染色与TUNEL染色法检测细胞凋亡情况。结果显示TGF-β1处理肝癌SMMC-7721细胞36小时,诱导近22%细胞发生凋亡;转染Smad4 RNAi病毒载体LT32和相应阴性对照病毒载体LTN,均未见SMMC-7721细胞发生明显的凋亡现象;转染LTN病毒载体也未对TGF-β1诱导的SMMC-7721细胞凋亡产生明显影响;而当细胞转染LT32病毒载体后,TGF-β1诱导的SMMC-7721细胞凋亡则几乎被完全抑制,从22%下降到5%,说明TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡作用受Smad4表达的影响,其信号转导为Smad4基因依赖性。 (7) TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡过程中p53表达与caspase 3活性的变化:TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡过程并不伴随着野生型p53基因的表达变化;沉默Smad4基因,亦未引起野生型p53基因的表达改变,表明在TGF-β1诱导SMMC-7721细胞凋亡的信号转导过程中p53可能并未作为TGF-β1-Smad通路相关基因发挥作用。但是,伴随着TGF-β1诱导的SMMC-7721细胞凋亡,caspase 3原酶被降解为小分子量的活性片断,表明caspase 3被激活;并且随着Smad4基因沉默对TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡作用的削弱,caspase 3的活性亦被抑制,表明TGF-β1诱导的SMMC-7721细胞凋亡与caspase 3的激活有关,caspase 3可能作为Smad4下游调节基因,参与TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的最终执行。 (8) TGF-β1-Smad信号通路改变对肝癌SMMC-7721细胞运动侵袭能力的影响:利用Transwell小室对细胞侵袭能力进行检测。SMMC-7721细胞在TGF-β1诱导36小时后,穿透基底膜成分Matrigel的数量增加了20%,表明TGF-β1能够促进肝癌SMMC-7721细胞的侵袭转移。与未转染和转染阴性对照病毒载体LTN组相比,转染Smad4 RNAi病毒载体LT32组细胞穿透基底膜成分Matrigel的数量也增加了24%,说明Smad4基因沉默可以显著增强肝癌细胞的运动侵袭能力。但是,在细胞转染LT32病毒载体后再加以TGF-β1刺激,既没有削弱TGF-β1诱导SMMC-7721细胞侵袭能力的增强,也没有发挥协同作用进一步增强细胞穿透上室基底膜的能力。 (9) TGF-β1-Smad信号通路改变对肝癌SMMC-7721细胞中MMP-2、MMP-9与VEGF表达的影响:肿瘤的侵袭转移与MMP-2和MMP-9的关系甚为密切。本研究结果显示伴随着TGF-β1的诱导与Smad4基因沉默所导致的SMMC-7721细胞运动侵袭能力的增强,MMP-2的表达明显上调,MMP-9的表达无明显变化。表明肝癌SMMC-7721细胞的侵袭可能与MMP-2密切相关,而与MMP-9无关。但是,细胞转染Smad4 RNAi病毒载体LT32后再加以TGF-β1刺激,在既没有削弱TGF-β1诱导SMMC-7721细胞侵袭能力的增强,也没有发挥协同作用进一步增强细胞穿透上室基底膜能力的同时,MMP-2表达的上调既没有被削弱也没有被进一步增强,表明TGF-β1诱导MMP-2表达的上调可能是Smad4非依赖性的。TGF-β1诱导SMMC-7721细胞侵袭增强的信号转导过程可能虽不依赖Smad4,但仍存在MMP-2的参与,TGF-β1通过增加MMP-2的表达促进SMMC-7721细胞的运动与侵袭。另外,我们发现TGF-β1可诱导肝癌SMMC-7721细胞VEGF表达明显上调;转染Smad4 RNAi相应的阴性对照病毒载体LTN,对SMMC-7721细胞中VEGF的表达没有影响,对TGF-β1诱导的VEGF表达的上调也未产生明显影响;SMMC-7721细胞转染Smad4 RNAi病毒载体LT32后,虽未对VEGF的表达产生影响,但TGF-β1诱导的VEGF表达的上调则几乎被完全抑制,表明在TGF-β1的信号转导过程中,VEGF的表达受Smad4调控,为其下游基因。 (10) MAPK通路在TGF-β1信号转导过程中的作用:在TGF-β1诱导SMMC-7721细胞生物学效应的过程中,伴随着JNK和p38的活化;Erk1/2的表达虽无明显变化,但一直处于较高活性状态。转染Smad4 RNAi相应的阴性对照病毒载体LTN,对SMMC-7721细胞中JNK和p38的活性没有影响,对TGF-β1诱导的JNK和p38的活化也未产生明显影响;SMMC-7721细胞转染Smad4 RNAi病毒载体LT32后,虽未对JNK和p38的活性产生影响,但TGF-β1诱导的JNK和p38的活化则几乎被完全抑制。这些结果表明TGF-β1诱导的SMMC-7721细胞生物学效应与高水平的Erk1/2活性状态有关;同时,JNK和p38的激活参与了TGF-β1的信号转导过程。并且JNK和p38的活性受Smad4调节,与Smad4相互作用,共同参与TGF-β1的信号转导。 结论 (1)肝细胞性肝癌组织中,TGF-β1-Smad信号转导通路上的主要因子TGF-β1、TβR-Ⅱ、NF-κB、Smad4及Smad7的表达均有异常,提示它们可能在肝细胞性肝癌的形成中发挥重要作用。 (2)鉴于Smad4在TGF-β1信号转导途径中的中枢地位,在成功构建Smad4 RNAi慢病毒载体有效沉默Smad4表达的基础上,以肝癌细胞株SMMC-7721为研究对象,进一步探讨TGF-β1的生物学效应及Smad4在其信号转导过程中的作用。研究发现TGF-β1可通过Smad4上调p16的表达,将细胞阻断于G_1期,诱导对SMMC-7721细胞的生长抑制作用;亦可通过Smad4激活caspase 3,促使SMMC-7721细胞的凋亡。 (3)另外,TGF-β1在肝癌细胞中通过诱导表达MMP-2和VEGF,提供合适的微环境,有利于肿瘤细胞的迁移和浸润血管上皮细胞,直接或间接的纵容肿瘤细胞的转移。 (4) MAPK通路中JNK和p38的激活也参与了TGF-β1的信号转导过程,并且JNK和p38的活性受Smad4调节,与Smad4相互作用,共同在应答TGF-β1的信号转导中发挥作用。 因此,TGF-β1-Smad信号转导通路在肝细胞性肝癌的发生发展中具有重要作用,广泛参与了肝癌细胞的增殖、凋亡以及侵袭转移等多种生物学过程的调节。对TGF-β1-Smad信号转导通路更加深入、全面的探讨将有助于我们进一步了解肝细胞性肝癌的发生发展机制,为对肝癌的分子诊断和基因治疗提供新的科学依据。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R735.7

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