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《南京医科大学》 2008年
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乳酸菌重组血红素加氧酶-1对肠道的保护作用

庞庆丰  
【摘要】: 临床上多种原因尤其是休克和内毒素血症可以导致肠粘膜屏障功能下降,肠腔内大量细菌或内毒素向肠腔外迁移,即发生内毒素和细菌移位(bacterial translocation,BT),继而导致多种炎症介质的过度释放,成为系统性炎症反应综合征(system inflammatory responsesyndrome,SIRS)和多器官功能不全综合征(multiple organdysfunction syndrome,MODS)的“发动机”。所以,如何保护肠粘膜屏障功能成为当前研究的一项重要课题。 益生菌(probiotics)是指能在生物体内存活,对生物体的健康有益的一类微生物。近年研究表明,益生菌能够纠正肠道微生态失衡,维持肠道屏障功能和减少内源性感染。然而,单一应用益生菌尚不足以防止严重感染、创伤、休克等所致的肠粘膜屏障功能的破坏。血红素加氧酶(heme oxygenase)是血红素分解代谢的限速酶,现已发现3种同工酶:HO-1、HO-2和HO-3,其中只有HO-1是诱导型酶,而肠道HO-1的诱导表达对于其屏障功能具有显著的保护作用。 因此,本研究克隆大鼠HO-1基因;以人类肠道有益菌群乳酸乳球菌为载体,构建能够表达具有生物活性HO-1的重组乳酸乳球菌(lactococcus lactis);然后观察重组乳酸乳球菌对失血性休克和内毒素血症大鼠肠道屏障的保护效果,从而为保护肠粘膜屏障功能提供新思路。 第一部分大鼠血红素加氧酶-1基因在乳酸乳球菌中的表达 目的:在乳酸乳球菌中表达大鼠血红素加氧酶-1基因。 方法:采用RT-PCR技术从大鼠脾总RNA中分离扩增血红素加氧酶HO-1基因,将该基因克隆进pGEM-T easy质粒中,转化大肠杆菌DH5_α提取质粒,鉴定HO-1基因。酶切后与pSEC质粒连接,经电击转化,将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中,转化子在含有氯霉素的脑心浸液培养基上培养。用乳链菌肽诱导HO-1表达,SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物,并采用分光光度法测定HO-1活性。 结果:表达产物相对分子量约为32 KD,表达量约为7.0 mg/L,HO-1活性为2.386 units/mg/h。 结论:乳酸乳球菌能够表达具有生物活性的大鼠HO-1。 第二部分LL-HO-1灌胃后重组血红素加氧酶-1在大鼠肠道的表达情况 目的:LL-HO-1灌胃后重组HO-1在大鼠肠道的表达情况。 方法:制备LL-HO-1悬液和乳酸乳球菌悬液;然后通过不同剂量和不同次数灌胃;在规定时间取回肠组织;采用酶联免疫吸附法和免疫组化法分析回肠组织HO-1的含量。 结果:5倍、10倍LL-HO-1组重组HO-1含量比20倍组高(P<0.01);LL-HO-1连续灌胃4天、7天组重组HO-1含量比10天组高(P<0.01)。 结论:LL-HO-1在肠道原位分泌重组HO-1的情况非常复杂。单纯增加LL-HO-1灌胃剂量和次数不能有效增加回肠中HO-1的含量,反而使回肠中HO-1的含量降低。 第三部分乳酸乳球菌重组HO-1对失血性休克大鼠肠道屏障的保护作用 目的:重组HO-1对失血性休克大鼠肠道屏障的保护效果。 方法:将50健康、清洁级、雄性SD大鼠随机分为5组(n=10):1)假手术组(sham group):大鼠只进行右股动脉分离和插管;2)LL-HO-1组:连续每天一次灌注活菌数达2.5×10~9 CFULL-HO-1菌液1ml3天,然后复制失血性休克模型复制;3)LL组:连续每天一次灌注活菌数达2.5×10~9 CFULL菌液1ml3天,然后复制失血性休克模型;4)LL-HO-1+ZnPP组:连续每天一次灌注活菌数达2.5×10~9 CFULL-HO-1菌液1ml3天;在复制失血性休克模型前3小时皮下注射锌原卟啉(zincprotoporphyrinⅨ,ZnPP)20μmol.kg~(-1);5)谷氨酰胺组(glutamine,Gln):连续每天一次灌胃0.65 g.kg~(-1)、溶解于PBS的Gln 3天。复制失血性休克模型,在液体复苏1h后取材,比较各组动物的休克复苏过程中平均动脉压、细菌移位、回肠组织的髓过氧化酶(MPO)活性及HO-1、肿瘤坏死因子-α和白介素-10的含量,并行回肠组织病理学检查。 结果:与LL组比较,LL-HO-1组的Chiu's评分、细菌移位发生率、MPO活性、肿瘤坏死因子-α含量明显降低(P<0.05);而HO-1、IL-10含量和MAP明显增加(P<0.05)。LL-HO-1对失血性休克肠黏膜屏障的保护作用可以被HO-1特异性拮抗剂锌原卟啉取消。 结论:乳酸乳球菌重组HO-1对失血性休克大鼠能够较好的保护肠黏膜屏障,可以明显减轻肠道炎症反应和细菌移位的发生率。 第四部分乳酸乳球菌重组血红素加氧酶-1对内毒素血症大鼠肠道的保护作用 目的:观察乳酸乳球菌重组血红素加氧酶-1对内毒素血症大鼠肠道症反应及肠黏膜屏障的保护效应。 方法:按随机数字表法将32只健康清洁级雄性SD大鼠分为4组(n=8):LL-HO-1组、LL组、Glu、LL-HO-1+ZnPP组。分别给予携带HO-1基因的乳酸乳球菌、乳酸乳球菌或谷氨酰胺,每日一次,共四次。第四天腹腔内注射内毒素,其中锌原卟啉于腹腔内注射内毒素前静脉注射,12小时后取末端回肠。比较各组动物的死亡率,检查肠组织病理学变化,并检测肠组织髓过氧化物酶活性、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-10和血红素加氧酶-1的含量。另取32只健康清洁级雄性SD大鼠同样分为四组,经过相应的处理后,观察其48小时的生存率。 结果:与LL-HO-1+ZnPP组比较,LL-HO-1组和Glu组的生存率均明显升高(P<0.01);与LL-HO-1+ZnPP组、LL组比较,LL-HO-1组和Glu组的Chiu's评分(P<0.01)和肠组织MPO活性明显降低(P<0.01),肠组织TNF-α的含量明显减低(P<0.01),IL-10的含量却显著的升高(P<0.01),HO-1的含量明显增加(P<0.01)。 结论:乳酸乳球菌重组血红素加氧酶-1能明显减轻肠道炎症反应;有较好的肠粘膜保护作用。 结论 1、重组血红素加氧酶-1乳酸乳球菌能够表达具有生物活性的重组HO-1。 2、LL-HO-1在肠道原位分泌重组HO-1的情况非常复杂。单纯增加LL-HO-1灌胃剂量和次数不能有效增加回肠中HO-1的含量,反而使回肠中HO-1的含量降低。 3、乳酸乳球菌重组HO-1对失血性休克大鼠能够较好的保护肠黏膜屏障,可以明显减轻肠道炎症反应和细菌移位的发生率。 4、乳酸乳球菌重组血红素加氧酶-1能明显减轻肠道炎症反应;有较好的肠粘膜保护作用。
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R96

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【参考文献】
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