表没食子儿茶素没食子酸酯及橙皮苷抑制UVA诱导的人角质形成细胞氧化损伤和凋亡的实验研究

【摘要】： 研究背景: 皮肤是机体第一道天然保护屏障,使机体免受外界物理、化学物质以及微生物侵害,维持机体内环境稳定。角质形成细胞是表皮的主要构成细胞,占表皮细胞的80%以上,皮肤屏障作用主要是由角质形成细胞完成。长期的紫外线照射不仅引起皮肤光老化而且与皮肤癌的发生有关。紫外线(UV)按波长分为长波紫外线(UVA,320～400nm),中波紫外线(UVB,290～320nm)和短波紫外线(UVC,200～290nm)。UVC被臭氧层阻挡,对人体皮肤几乎没有影响;UVB的主要靶部位是表皮,小部分可达真皮浅层,诱发红斑、日晒伤,并和皮肤肿瘤发生有关;长波紫外线(UVA)占到达地球表面紫外线的90%,并且穿透力强,可以穿透表皮进入真皮,因此UVA在紫外线对皮肤的损伤中占重要地位。 在对UVA致凋亡作用的研究中,人们认为UVA主要是通过ROS来引发细胞及其分子氧化损伤而介导的。紫外线诱导皮肤产生的ROS主要有氢氧根(OH~-)、超氧阴离子(O_2~-)、单线态氧(~1O_2)和过氧化氢(H_2O_2)等。ROS可以破坏细胞蛋白质和酶的活性,可以直接或间接引起DNA的氧化损伤,导致细胞坏死和凋亡。线粒体是细胞能量的动力加工厂。氧自由基可以启动线粒体的去极化,增加线粒体膜的通透性,使与凋亡相关的蛋白质和酶类释放入细胞质,激活下游效应器诱发细胞凋亡。在正常情况下,细胞内存在一系列抗过氧化物酶,如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等,它们可清除细胞内产生的ROS,减轻细胞氧化损伤。当细胞内ROS生成增加、清除ROS能力下降和抗氧化能力减弱时可致细胞损伤,出现细胞凋亡。 近年来,天然化合防护剂己得到普遍关注。例如,维生素C,E及β-胡萝卜素已成功应用于皮肤保健产品中。传统中药绿茶提取物茶多酚(tea polyphenols,TP)中的主要活性成分没食子儿茶素没食子酸脂(epigallocatechingallate,EGCG)及橙皮苷(hesperidin,HPD)等有着广泛的生物学效应。鉴于对该两种活性成分在UVA的光保护作用中尚不明确,特别是对UVA照射后活性氧的产生和清除、以及线粒体膜电位保护作用,抑制凋亡未见报道。故本项目旨在探讨EGCG以及HPD是否能对UVA诱导的人角质形成细胞(HaCaT细胞株)的氧化损伤和凋亡起保护作用以及其可能作用机制。籍此可为天然防晒剂的开发和实际应用提供理论依据和实验参考数据。 目的 观察EGCG以及HPD对体外培养的HaCaT细胞有无毒性作用;观察UVA照射对HaCaT细胞及其线粒体的氧化损伤作用;观察EGCG以及HPD对UVA照射的HaCaT细胞的光保护作用,探讨其可能作用机制。 方法 1.细胞培养:以含10%小牛血清的RMPI1640培养基培养HaCaT细胞,定量接种于培养皿或96孔板中。 2.紫外线照射:根据实验设计定时定量照射培养细胞,并分别于UVA照射前后加入相关药物进行干预处理。 3.细胞损伤及细胞活性检测:MTT法检测细胞增殖活性。 4.细胞氧化损伤检测:比色法检测UVA照射后细胞上清液中的超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,总抗氧化能力(the total antioxidation capability)以及丙二醛(MDA)含量变化 5.线粒体膜电位变化检测:流式细胞仪检测线粒体膜电位变化 6.细胞凋亡检测:TUNEL法或流式细胞仪检测不同处理条件下细胞凋亡率。 7.统计学分析:采用单因素方差分析,数据处理应用SPSS11.0统计软件,P＜0.05时差异有统计学意义。 结果 1.EGCG和HPD及10J/cm~2UVA照射对HaCaT细胞增殖活性的影响 EGCG浓度在200μg/ml及以下时,对HaCaT细胞无明显毒副作用;HPD浓度在320μg/ml及以下时对HaCaT细胞无明显毒副作用。经10J/cm~2UVA照射后,A值为(0.3426±0.0075)明显小于空白对照组(0.5437±0.1312),说明UVA明显抑制HaCaT细胞增殖活性。不同浓度EGCG和HPD处理的HaCaT增殖活性明显高于单纯10J/cm~2UVA照射组(P＜0.05)。结果显示EGCG和HPD可明显减轻UVA照光对细胞增殖的抑制作用。 2.EGCG和HPD及10J/cm~2UVA照射对HaCaT细胞SOD、GSH-Px、总抗氧化能力和MDA含量的影响。 UVA照射后细胞SOD和GSH-Px活力明显下降,总抗氧化能力下降,MDA含量增加,差异有统计学意义(P＜0.05)。EGCG处理后照光组SOD和GSH-Px活力与UVA单独照射组相比分别升高31和6.2倍,MDA含量显著减少,下降率为59%。HPD处理后照光组SOD,总抗氧能力与UVA单独照射组相比明显升高,分别升高42倍和10倍。MDA下降65%。 3.EGCG和HPD对10J/cm~2UVA照射后HaCaT细胞线粒体膜电位的影响。 10J/cm~2UVA照射后细胞线粒体膜通透性增加,线粒体膜电势降低,去极化与对照组相比明显增强;EGCG和HPD处理后,10J/cm~2UVA照射膜电位变化相对单独10J/cm~2UVA照射组分别明显降低25%和15%,差异有统计学意义(P＜0.05);EGCG和HPD单独处理HaCaT细胞,其膜电位变化与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。 4.EGCG和HPD对10J/cm~2UVA照射后HaCaT细胞凋亡率的影响 EGCG:TUNEL法测空白组凋亡率为0.68%,10J/cm~2UVA照光后细胞凋亡率为6.72%,说明UVA可诱导细胞凋亡;EGCG处理后UVA照射组的阳性凋亡细胞率为3.28%,相对单纯UVA照射组减少约52%(P＜0.05)。 HPD:流式细胞仪法测空白组凋亡率为0.72%,10J/cm~2UVA照光后凋亡细胞率为7.86%,HPD处理后凋亡细胞率4.34%,相对单纯UVA照射组减少约45%(P＜0.05)。 结论 本研究结果显示:EGCG在≤200μg/ml浓度、HPD在≤320μg/ml时对培养状态下的HaCaT细胞无明显毒副作用。EGCG和HPD可明显减轻10J/cm~2UVA照射对细胞增殖的抑制性影响。UVA照射后细胞的SOD、GSH-Px和总抗氧化能力明显下降,而EGCG或HPD处理可部分恢复这些氧化性损伤。加用EGCG和HPD处理细胞可改善UVA照射降低线粒体膜电位及增强去极化的作用,进而减少细胞凋亡率。本研究初步证实EGCG和HPD可减轻UVA诱导ROS产生,减轻细胞凋亡,其机制可能与增强HaCaT细胞清除自由基、抗氧化损伤及保护线粒体等作用环节有关。