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灵芝抗肝癌活性组分的筛选及其固体分散体的制备

陆慧  
【摘要】:近年来灵芝的抗肿瘤活性越来越多的被人们关注,灵芝水溶性提取物中多糖类组分能增强机体免疫力,醇溶性提取物对肿瘤细胞有直接杀伤作用。本论文重点探讨灵芝醇溶性组分(即总组分)的抗肿瘤物质基础,采用现代提取分离手段得到灵芝总组分,通过NaHCO3溶液将总组分分为酸性组分和中性组分,运用肝癌细胞和动物模型,进行三个组分与药效相关性的研究,结果显示山酸性组分和中性组分有机配伍起来的总组分对肝癌生长抑制率最高,比单独使用酸性组分或者中性组分抗肝癌效果好;酸性组分和中性组分共同构成灵芝抗肿瘤的物质基础;其中中性组分体内外抗肝癌作用均强于酸性组分,是灵芝抗肝癌的关键活性组分;并采用GC-MS、HPLC-MS分析酸性组分和中性组分内部的一维结构,为灵芝深层次开发提供科学依据,同时为灵芝制剂研究提供思路与方法。本论文研究组分的理化性质后,将活性组分制成固体分散体,体内药效显示抗肿瘤作用明显提高。1.灵芝各组分体内外抗肝癌作用(1)体外对人肝癌BEL-7402细胞株的细胞毒活性 采用MTT法比较不同产地灵芝的抗肿瘤作用,各产地总组分均有较强增殖抑制作用,其中中性组分抗肿瘤作用均远大于相应的酸性组分,且不同产地的酸性组分抗肿瘤作用变化较大,但不能因为酸性组分抑制率相对较弱就轻易将其从活性组分中剔除。浙江安吉县产地灵芝总组分、中性组分和酸性组分对BEL-7402细胞增殖的抑制作用均最强,在给药量为100μg·mL-1时,抑制率分别为94.06%、99.56%、60.72%。四个产地中只有海南五指山产地灵芝的酸性组分未表现出细胞增殖抑制作用,此现象比较有趣,在100μg·mL-1时,其总组分抑制率为66.02%,中性组分的抑制率为85.18%,总组分表现出来的细胞增殖抑制作用主要是依赖中性组分,进一步证实中性组分是总组分中抗肿瘤的核心组分。 根据细胞筛选结果,确定后期实验均以浙江安吉县赤芝为原料进行实验研究,总组分含固量为28.08 mg·g-1,酸性组分含固量为13.20 mg·g-1,中性组分含固量为13.20 mg·g-1,酸性组分和中性组分按含固量1:1组成总组分。赤芝总组分对人肝癌BEL-7402细胞的IC50为1.04 mg生药·mL-1,中性组分IC5o为1.48 mg生药·mL-1,酸性组分IC5o5 mg生药·mL-1,同等生药量下总组分的抗肿瘤效果优于单独使用中性组分。通过细胞流式检测,发现随着给药浓度增大,三个组分均可使肿瘤细胞出现明显的细胞凋亡,各组分表现出不同的细胞周期阻滞,总组分和中性组分使细胞周期阻滞在G2/M期,酸性组分则使细胞出现期G1周期阻滞。 (2)体内对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤活性研究 采用右腋皮下接种小鼠H22肝癌细胞,建立小鼠皮下移植性肿瘤模型,研究三个组分的体内抗肿瘤作用,200mg·kg-1·d-1给药8天后,总组分显著抑制腋下瘤体的生长,抑瘤率分别为36.14%。同等生药量下,即中性组分和酸性组分按100mg·kg-1·d-1给药8天后,抑制率分别为28.02%和19.45%。将中性组分的给药量提高一倍即200mg·kg-1·d-1时,抑制率才达到33.08%,达到总组分的疗效。酸性组分和中性组分共同构成总组分的抗肿瘤物质基础,仅依靠其中的任一组分抗肿瘤效果会减弱。 2.灵芝抗肝癌物质基础的研究 选择体内外抗肿瘤效果较好的浙江产地赤芝考察提取工艺,引入绿色无污染的超临界CO2萃取工艺(95%乙醇作为火带剂)取代传统有机溶剂回流提取工艺,含固量28.08±0.02mg·g-1,灵芝酸B含量0.363±0.005 mg·g-1,麦角甾醇含量0.963±0.007 mg·g-1。超临界萃取时间缩短为1.5 h,95%乙醇用量仅为药材的3倍量,大大节省有机溶剂。 将总组分划分为中性组分和酸性组分,并对其用HPLC进行表征,酸性成分集中在80min前出峰,中性组分极性偏小,集中在80min-140min出峰。不同产地灵芝性状上差别很大,并对不同产地各组分进行HPLC表征,产地不同酸性组分含量变化较大,海南灵芝中几乎不含酸性组分,所以其酸性组分无细胞增殖抑制作用。 酸性组分HPLC-MS分析显示含有大量三萜酸类成分;中性组分为抗肿瘤核心组分,对其进行HPLC-MS和GC-MS分析后发现含有脂肪酸、甾醇类和三萜类成分,推测除三萜类,脂肪酸和甾醇类对中性组分的抗肿瘤作用可能有贡献。 3.灵芝有效组分固体分散体的初步研制 对灵芝各组分理化性质进行研究,中性组分和酸性组分均在弱碱性环境中表观溶解度略好,其值在100μg·mL-1-500μg·mL-1之间属于极微溶解物质。中性组分和酸性组分在水中的表观油水分配系数logP分别为2.01和1.20,推测中性组分和酸性组分胃肠吸收好。水中溶解度低,膜透过性可以,药物的溶出是吸收的限速过程,为了改善药物的溶出本实验考虑将灵芝活性组分制成吲体分散体。 通过体外溶出度筛选固体分散体的载体(PVPK30、Poloxamerl88、PEG6000)及比例(1:1、1:4、1:6、1:9),最终选择灵芝总组分PVPK30(1:6)制备固体分散体。总组分、总组分-PVPK30物理混合物、总组分PVPK30吲体分散体(1:9)在60min时累积溶出度分别为15.74%、31.80%和97.23%。用X-射线衍射技术对总组分固体分散体进行了表征,结果表明总组分以无定型状态存在。动物移植瘤模型进行固体分散体体内药效研究,总组分、中性组分和酸性组分(200mg·kg-1·d-1)制成固体分散体后抗肿瘤作用均比对应的混悬液显著增强,总组分固体分散体抑制率为57.27%,总组分混悬液为36.14%,中性组分固体分散体抑制率为55.90%,中性组分混悬液为33.08%,酸性组分固体分散体抑制率为43.80%,酸性组分混悬液为24.04%,固体分散体能提高活性组分的体外溶出并增强其体内抗肿瘤活性。


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