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《南京中医药大学》 2011年
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补气活血法防治失神经肌萎缩的机理研究

周岚  
【摘要】:目的 通过观察补阳还五汤对损伤神经及其靶肌形态与功能的影响,并应用基因芯片技术寻找补阳还五汤防治失神经肌萎缩的分子靶点,探讨补气活血法防治失神经肌萎缩的生物学作用及其机理,为中医药防治失神经肌萎缩提供新的科学资料。 方法 1补气活血法防治失神经肌萎缩的理论探讨 系统地整理古代有关痿证文献及现代中医学家对痿证的研究;探讨失神经肌萎缩的现代医学研究概况及补气活血法的防治机理;并收集近年来有关补阳还五汤的文献资料:包括组方、配伍、及其现代药理研究。 2补阳还五汤延缓大鼠胫前肌失神经肌萎缩的实验研究 SPF级雄性SD大鼠60只,随机分为6组:BYHWD高、中、低剂量组(剂量分别为25.92、12.96、6.48g生药/kg)、弥可保组(剂量为625μg/kg)、模型组、假手术组。采用大鼠腓总神经5mm夹伤模型,每日灌胃给药。术后18天行足迹实验测定展趾功能;应用电生理学技术测定神经传导速度与复合肌动作电位振幅;应用光电镜技术从形态学上测定再生有髓神经纤维数、髓鞘厚度、胫前肌截面积与湿重比;观察补阳还五汤给药后大鼠腓总神经再生与功能恢复情况及其对胫前肌失神经肌萎缩的防治作用。 3补阳还五汤延缓大鼠胫前肌失神经肌萎缩的的分子机制研究 SPF级雄性SD大鼠随机分为补阳还五汤高剂量组与模型组,每组10只动物。模型建立与术后给药同上。术后第7、18天取材进行芯片研究。并用实时荧光定量PCR验证部分差异表达基因,以期找出补阳还五汤对失神经肌萎缩起保护作用的可能分子靶点。 结果 1.失神经肌萎缩属于祖国医学的“痿证”范畴,病性为本虚标实。元气大伤为本,血脉瘀阻为标;元气大伤、血脉瘀阻是失神经肌萎缩发病的主要病理机制;补气活血是其主要治法。补阳还五汤是补气活血法的代表方剂,用以治疗本病,切合病机。 2.展趾功能:各组大鼠TSF值均随术后时间的推移逐渐增加,与第3天的展趾功能比较,模型组、中、低剂量组从第15天开始出现显著性差异(P0.05或P0.01),而高剂量组与弥可保组第9天开始就出现显著性差异(P0.05或P0.01)。另外,术后12天开始BYHWD高剂量组、弥可保组TSF均显著高于模型组(P0.05或P0.01);术后15天及18天,BYHWD高、中剂量组、弥可保组TSF与模型组比较有显著性差异(P0.05或P0.01)。 3.大鼠术侧腓总神经近、远侧端CMAP波幅:与假手术组相比,其余各组波幅均明显降低(P0.01);而与模型组比较,BYHWD高、中剂量组和弥可保组波幅均显著增高(P0.01)。 4.腓总神经传导速度:与假手术组相比,其余各组神经传导速度均明显降低(P0.01);而与模型组相比,BYHWD中、高剂量组和弥可保组均显著增高(P0.05或P0.01)。 5.胫前肌形态学观察:假手术组胫前肌横切面可见肌纤维截面积较大,形态较规则,且很少见到结缔组织;模型组与假手术组相比截面积明显减少,且表现为大小不一,形态不规则,肌纤维结构紊乱,细胞间隙明显增宽,结缔组织明显增生,肌纤维明显萎缩变性;BYHWD各组和弥可保组与假手术组相比截面积有所减小,细胞间隙增宽,肌纤维轻度萎缩变性,但形态较规则,结构尚清晰、染色较均一,结缔组织增生不明显。 6.胫前肌湿重比:与假手术组相比,各组动物术侧胫前肌湿重比皆不同程度的降低(P0.01);而与模型组相比,BYHWD中、高剂量组和弥可保组均显著增高(P0.05或P0.01)。 7.胫前肌横截面积:与假手术组相比,各组动物术侧胫前肌横截面积皆不同程度的减小(P0.01);与模型组相比,BYHWD各组和弥可保组明显增加(P0.01);弥可保组与BYHWD高剂量组相比差异有显著性(P0.05)。 8.运动终板:术后18天,大鼠胫前肌运动终板乙酰胆碱酯酶染色后观察,可见假手术组运动终板为棕黑色,纵切面上其形状为椭圆形或圆形,着色均匀。弥可保组与BYHWD高剂量组仅表现为运动终板边缘不如假手术组光滑;BYHWD中、低剂量组与模型组的运动终板表现为数量逐渐减少,形态逐渐不规则,边缘逐渐不光滑;终板内部着色也逐渐变浅。 9.神经轴突NF免疫荧光组织化学染色观察:假手术组神经轴突排列密集,分布整齐;模型组轴突密度明显低于假手术组,且排列紊乱;而BYHWD组和弥可保组轴突密度较模型组高,分布也较整齐。其中,补阳还五汤高剂量组和弥可保组的再生神经轴突较多,而中、低剂量组的再生神经较少。 10.电镜形态学观察:假手术组有髓神经纤维成熟。髓鞘厚。排列致密;BYHWD各组和弥可保组可见较成熟的、排列较致密的有髓纤维,髓鞘较厚;而模型组有髓神经纤维排列稀疏紊乱,髓鞘较薄,成熟度欠佳,尚可见较为明显的退变现象。 11.有髓神经纤维计数、髓鞘厚度:与假手术组相比,模型组、BYHWD各组、弥可保组大鼠术侧腓总神经夹伤远端再生有髓神经纤维计数、髓鞘厚度明显降低(P0.01);与模型组比较,BYHWD高、中剂量组和弥可保组显著增高(P0.01)。 12.芯片结果:BYHWD作用胫前肌第7天,芯片分析结果表明BYHWD高剂量组与模型组相比,基因表达谱有显著差异,其中4条基因表达上调,3条基因下调。而BYHWD作用胫前肌18天后,差异表达基因中16条基因上调,13条基因下调。差异表达基因中变化最明显的是Angpt14,大约上调15倍,它与血管新生密切相关;其次就是Pik3c2g,它可活化Akt后参与多种信号转导而发挥广泛的生物学效应。这些差异表达基因具有的生物学功能可分为直接和间接延缓肌萎缩两大类。其中促进肌肉蛋白合成,抑制其分解,能直接延缓失神经肌萎缩的功能有:促进蛋白质合成,细胞周期调控,抗凋亡,抑制泛素化途径,促进肌细胞增殖与分化。而通过其他机制间接延缓失神经肌萎缩的功能有:血管重塑,血管新生,改善微循环,神经保护,胶原合成,能量合成增加,抗氧化损伤。以上功能按出现频率由多至少依次排列为:能量合成增加(8次)、血管新生(5次)、抗凋亡(5次)、抗氧化(4次)、神经保护(4次);其他功能相对较少。另外,还有一些差异表达基因功能不明,或者目前还不能确定是否具有保护失神经肌萎缩的作用,有待进一步的深入研究。 13. qRT-PCR检测Angpt14与Pik3c2g基因在补阳还五汤高剂量组与模型组的差异表达,结果与芯片结果一致,说明芯片结果可靠。 结论 1.补阳还五汤对大鼠胫前肌失神经肌萎缩有较好的直接防治作用;并有利于轴突生长和髓鞘形成,通过促进大鼠夹伤神经再生与功能恢复,间接延缓失神经肌萎缩的发生。 2.补阳还五汤对失神经肌萎缩的保护作用与它对多种相关基因的调控有关。其机理可能通过大补元气,活血化瘀促进能量合成与血管新生、抑制细胞凋亡、抗氧化、保护神经等方面来防治失神经肌萎缩的发生,其机制有待进一步的研究。 3.补阳还五汤还可能通过大补元气激活PI3K/Akt信号通路促进蛋白质合成、减少蛋白降解、促进血管新生、肌卫星细胞的增殖与分化、细胞周期调控等多种生理功能来延缓失神经肌萎缩的发生。 4.补气活血法是是防治失神经肌萎缩的有效方法,它可能是通过调控基因表达来实现其保护作用。
【学位授予单位】:南京中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R277.7

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