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《南京中医药大学》 2011年
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榄香烯注射液联合重组人血管内皮抑素抗肝癌血管生成的实验研究

汤秀红  
【摘要】:[背景与目的] 原发性肝癌是全球性的常见恶性肿瘤,尤其在我国高发,因起病隐袭、进展迅速和早诊困难,80%以上的患者确诊时已达晚期,失去了外科手术和局部治疗的机会,预后极差,急需寻求有效的治疗药物或方法来改善生存状态。实验研究和临床实践表明,肝癌是富血管肿瘤,抗肿瘤血管生成治疗具有重要价值。榄香烯注射液(Elemene)是从我国传统中药姜科植物温郁金(莪术)中提取的萜烯类化合物制成的现代中药制剂,重组人血管内皮抑素针剂(Endostar,恩度)是以血管内皮细胞为主要靶点的分子靶向药物,两药均具有一定的抗肿瘤血管生成作用,并且均已上市,用于治疗非小细胞肺癌等肿瘤。本实验研究旨在积极探讨榄香烯注射液联合恩度对肝癌血管生成的影响,特别是联合应用是否具有协同增效作用,并进一步探讨其作用机制。 [方法] 1、体内研究:(1)以小鼠肝癌H22细胞株建立ICR小鼠皮下移植瘤模型,分别用50mg/kg、75mg/kg和100mg/kg剂量的榄香烯注射液单药,5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg剂量的恩度单药,连续腹腔注射用药8天后,观察瘤体大小变化,计算抑瘤率并确定最佳疗效的单药剂量。(2)分别采用不同剂量的两药联合给予荷瘤小鼠,观察瘤体大小变化,计算抑瘤率并确定能提高抑瘤效果的联合组单药剂量。(3)用上述实验中已确定的具有提高抑瘤疗效的两单药剂量,单独或联合给予ICR小鼠,分为4组,即生理盐水组、恩度单药组、榄香烯注射液单药组和两药联合组,计算不同组小鼠的抑瘤率和观察各组小鼠的生存期,来确定两药是否具有协同作用;并且进一步探讨两药协同作用的机制:①免疫组化法,检测肿瘤组织中微血管密度(MVD)和肿瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)表达;②酶联免疫吸附实验(ELISA),检测小鼠血清中VEGF、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和细胞外信号调节激酶(ERK)等促血管生长因子蛋白的表达;③流式细胞术,检测小鼠循环血内皮细胞占外周有核细胞的百分比;④逆转录PCR (RT-PCR)法,检测肿瘤组织中VEGF mRNA、bFGF mRNA的表达;⑤采用透射电镜,观察肿瘤细胞超微结构的改变。 2、体外研究:采用甲基噻唑基四唑/吩嗪硫酸二甲酯(MTS/PMS)法,检测50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml浓度的恩度分别与25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml浓度的榄香烯注射液联合作用于人肝癌Bel-7402细胞株后的吸光度(OD)值,计算细胞增殖抑制率。 [结果] 体内实验:(1)榄香烯最佳的单药抑瘤剂量为75mg/kg;恩度单药最佳的抑瘤剂量为10mg/kg;(2)联合应用能够提高抑瘤作用的两药剂量分别是:恩度5mg/kg和榄香烯75mg/kg;(3)分别采用生理盐水、5mg/kg恩度单药、75mg/kg榄香烯单药和两药联合处理荷瘤小鼠,联合组与生理盐水组、各单药组相比:抑瘤率明显提高,联合组抑瘤率为76.2%,恩度单药组为16.9%,榄香烯单药组为43.5%;生存期延长:联合组中位生存(23.8±2.7)天,恩度单药组中位生存(19.9±2.1)天,揽香烯单药组中位生存(20.6±2.1)天,生理盐水组中位生存(16.9±2.0)天。其他检测指标:①免疫组化:联合组MVD和VEGF明显减少,MVD联合组为(4.88±1.56)个,恩度单药组为(9.42±1.67)个,榄香烯单药组为(9.29±2.20)个,生理盐水组为(11.88±2.42)个;VEGF联合组为(1.33±0.75)分,恩度单药组为(3.17±0.90)分,榄香烯单药组为(3.0±0.82)分,生理盐水组为(3.67±1.37)分。②流式细胞术检测:联合组循环血中活的内皮细胞数占外周有核细胞的百分比明显减少,联合组为(0.27±0.12)%,恩度单药组为(1.27±0.17)%,榄香烯单药组为(1.15±0.37)%,生理盐水组为(2.97±1.17)%。③ELISA检测:联合组血清中VEGF、bFGF、MAPK和ERK含量明显减少,VEGFR-2的含量无显著变化。④PT-PCR检测:联合组VEGF mRNA相对灰度值较各单用组无明显变化,但各单药组和联合组较生理盐水组明显下降(P0.01);联合组bFGF mRNA(?)目对灰度值较各单用组无明显变化,但各单药组和联合组较生理盐水组明显下降(P0.05)。⑤透射电镜观察:联合组细胞损伤较各单用组明显加重。 2、体外实验:经计算细胞增殖抑制率,各联合组对人肝癌Bel-7402细胞株的增殖抑制率与相应的单药恩度组相比均明显增加(P0.01);各联合组与相应的单药榄香烯组相比,增殖抑制率均增加,但是只有榄香烯100μg/ml和200μg/ml联合组的细胞增殖抑制率与相应的单药组相比差异有统计学意义(P0.05),榄香烯注射液25μg/ml和50μg/ml联合组与相应的单药组相比差异无统计学意义(P0.05)。 [结论] 体内实验证明,适当剂量的榄香烯注射液与恩度联合应用具有明显的协同增效作用,可以提高抗ICR小鼠肝癌疗效和抑制肿瘤血管生成,并能延长荷瘤小鼠生存期。体外实验证明,适当浓度的榄香烯注射液与恩度联合应用,能提高对肝癌细胞抑制杀伤作用。两者联合协同增效的可能机制是:①.能增加对肝癌细胞的直接抑制杀伤作用;②.能有效减少肿瘤组织MVD,抑制肿瘤组织VEGF的表达,降低血清中VEGF、bFGF、MAPK和ERK等促血管生长因子的表达;③.能有效降低血清中活的内皮细胞占外周有核细胞的百分比;④.同时具有对肿瘤细胞的抑制杀伤协同作用和抑制肿瘤血管生成的协同作用,两种作用相辅相成,互相补充。 本研究首次证明榄香烯注射液联合恩度抗肝癌具有协同增效作用,其机制主要是增强了对肝癌细胞的直接抑制作用,同时增强了抗肿瘤血管生成。因此,提示在临床实践中,可以积极探索两药联合应用,值得进一步开展多中心临床研究。此外,本研究结果对于将其它现代中药制剂与分子靶向药物联合应用以提高疗效,具有重要的启迪意义。
【学位授予单位】:南京中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R285

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