牙齿发育的信号调控机制及淫羊藿苷的干预研究
【摘要】：研究目的：
1.进一步明确将斑马鱼作为牙齿发生发育分子生物学研究模型的可行性和先进性。
2.研究牙齿发育的重要信号因子(Pax9基因、Pitx2基因)在斑马鱼牙齿萌出与替换过程中的表达部位和时间,以探讨Pax9基因、Pitx2基因在牙发生发育过程中的作用机制及作用途径。
3.研究淫羊藿苷对牙齿生长发育的影响。这将加快实现牙齿再生目标,并将为选取中药进行牙齿再生的体内实验提供一定的理论依据。
研究方法：
1.斑马鱼的饲养及其受精卵的获得：将饲养野生型斑马鱼的水温控制在28.5℃,设定其昼夜规律分别为14小时和10小时。将通过自然交配获得的受精卵饲养于28.5℃水中。斑马鱼的发育阶段按下述方法来划分：孵化期(0—6天龄)；幼虫期(1—4周龄,即7—49天龄)；幼体期(1—3月龄,即30—89天龄)；成熟期(3月龄以上)。
2.成年斑马鱼牙齿形态和组织学观察：在体视显微镜下,解剖成年斑马鱼鳃弓,观察其牙齿,并做石蜡切片和HE染色观察。取单个牙齿进行组织学标本处理,扫描电镜下观察其显微结构。
3.针对Pax9基因原位杂交探针的制备：根据斑马鱼Pax9基因mRNA序列(GenBank: NM_131298)设计和合成针对Pax9的引物(F:5'-gcaagcttatggaaatctgcagaggcct; R: 5'-gctggatcccgctcgtcctcctggaa gtagaa)。抽提斑马鱼基因组总RNA,反转录成cDNA,并以此为模板,扩增Pax9基因序列。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。将纯化的PCR扩增产物连接到pGEMT (Promage, Cat.#A3600)载体中,然后转化到DH5α感受态菌株中克隆扩增质粒。将大量扩增抽提得到的连接载体质粒经内切酶消化,在含有地高辛标记的UTP的体外转录系统中,以T7聚合酶催化合成地高辛标记的RNA探针,用于整胚原位杂交。
4.Pax9基因在受精72h以内斑马鱼胚胎中的分布和表达：参考Westerfield M. The Zebrafish Book. Eugene:University of Oregon Press,1995.中的整胚原位杂交和胚胎切片方法,取不同发育阶段的胚胎(以4h为观察间隔),用4%多聚甲醛溶液固定过夜(至少固定12h),保存于甲醇溶液中,置-20℃备用。用1×PBST溶液洗去多余的甲醇溶液,将胚胎置于65℃水浴箱进行预杂交3h,然后加入所合成的反义RNA探针,65℃水浴杂交过夜。用0.2×SSC溶液洗去多余的探针,加入anti-Dig-AP与反义RNA探针结合过夜。将未结合的抗体用1×PBST溶液洗去,再加入(BCIP/NBT/NTMT)显色30min,迅速用1×PBST溶液洗去多余的显色液,将此胚胎直接在显微镜下观察并记录结果。
5.通过制备针对Pitx2基因的探针(同研究方法3),利用整胚原位杂交技术(同研究方法4)观察Pitx2基因在斑马鱼牙齿早期发育中的表达情况。
6.研究淫羊藿苷对牙齿生长发育的影响：在饲养野生型斑马鱼的水中加入淫羊藿苷,观察45天后斑马鱼牙齿生长发育的变化。在扫描电镜下观察其牙齿的显微结构,并对Ca、P等微量元素做能谱分析。
7.研究淫羊藿苷对人牙龈成纤维细胞的中药干预作用：对体外培养的人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGF),用MTT法检测不同浓度的淫羊藿苷(0.001、0.01、0.1μg/mL)、不同时间(24、48、72、96h)作用下HGF的增殖水平。
研究结果：
1、扫描电镜下,斑马鱼牙齿硬组织也具有类似人类牙釉质和牙本质样的结构。人类牙齿的釉质表面有平行排列的与牙长轴垂直的浅凹线纹和不规则的圆形小凹。斑马鱼牙齿表面未见浅凹线纹,但是有一些与牙长轴垂直的颜色较深的条带,在外形变化大的牙尖处尤为明显,这可能同人类牙釉质表面的线纹一样和釉质沉积有关。人类牙齿的牙本质具有牙本质小管,为多孔性组织结构,牙本质构成髓腔,髓腔内充满牙髓等软组织。斑马鱼的釉质内侧组织也呈多孔性疏松组织结构,具有很多贯穿其内的孔隙,与人类牙齿的牙本质结构相似。斑马鱼牙齿的牙本质也围成一髓腔,其内也可见软组织。HE染色进一步观察到红染的牙本质内部为一髓腔,髓腔内具有丰富的牙髓细胞。
2、得到了Pax9基因在0到7天各时期斑马鱼胚胎中的表达资料,其中Pax9基因在受精16h的斑马鱼胚胎中开始有特异性信号出现,还可以明显地看到鳃弓(鳃弓,包括牙齿是由神经嵴细胞迁徙分化而来)上的特异性信号从24h-72h的迁徙和发育的过程。
3.得到了Pitx2基因在0到7天各时期斑马鱼胚胎中的表达资料,明显地看到鳃弓上的特异性信号从16h-72h的迁徙和发育的过程。
4.与对照组相比,实验组(加淫羊藿苷组)中斑马鱼牙齿冠1/3和中1/3的Ca含量显著升高,P含量显著降低,Ca/P比值显著升高。淫羊藿苷对斑马鱼牙齿生长发育中的钙化沉积有明显的促进作用。
5.淫羊藿苷(0.001～0.1μg/mL)对人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts, HGF)的增殖具有促进作用(P0.01),而且呈时间依赖性,促进HGF增殖的最佳浓度为001μg/mL。
结论：
1.进一步明确了斑马鱼作为牙发生发育分子生物学研究模型的可行性和先进性。从组织结构和超微结构上分析,斑马鱼牙齿和人类牙齿具有相似性,能够作为研究牙齿发生发育的新型模式动物。
2.掌握了Pax9基因、Pitx2基因在斑马鱼牙齿发育和替换过程中的的早期表达情况。为揭示Pax9基因、Pitx2基因功能及信号通路等后续研究奠定了基础。
3.淫羊藿苷对牙齿生长发育中的钙化沉积有明显的促进作用。淫羊藿苷对人牙龈成纤维细胞有中药干预作用,可以促进牙龈再生。这将为选取中药进行促牙周组织再生的体内实验提供一定的依据。利用中西医结合共同研究牙齿生长发育的机制,加快实现牙齿再生
【关键词】：斑马鱼 模式动物 牙齿发育 牙齿再生 原位杂交 淫羊藿苷 【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R285.5
【目录】：
- 摘要7-10
- ABSTRACT10-13
- 绪论13-16
- 1、牙发生发育研究是牙再生研究的必要前提13
- 2、斑马鱼是牙发育生物学研究的新型模式动物13-15
- 3、Pax9基因、Pitx2基因是调控牙发生发育的重要信号因子15
- 4、研究淫羊藿苷对牙齿生长发育的中药干预作用15-16
- 第一章 文献综述16-31
- (一) 牙齿的发育与再生研究16-23
- 1 牙齿的发育16-17
- 2 牙齿的再生17-19
- 2.1 组织工程的可行性17
- 2.2 干细胞的发现17-18
- 2.3 信号分子调控机制的作用18-19
- 3 总结19-20
- 参考文献20-23
- (二) 研究牙发生发育的新型模式生物——斑马鱼23-26
- 参考文献25-26
- (三) 中医在口腔医学的研究26-31
- 1. 中医生理26
- 2. 中医病理及治疗26-28
- 3. 现代中医药研究28-31
- 第二章 实验研究31-64
- (一) 成年斑马鱼牙齿的形态学研究31-40
- 1 材料和方法32
- 2 结果32-37
- 2.1 成年斑马鱼鳃弓阿辛兰染色和茜素红染色观察结果32-34
- 2.2 成年斑马鱼牙齿扫描电镜观察结果34-36
- 2.3 成年斑马鱼牙齿的HE染色观察结果36-37
- 3 讨论37-38
- 参考文献38-40
- (二) Pax9基因在斑马鱼早期发育阶段鳃弓中的表达40-47
- 1. 材料和方法40-42
- 2 结果42-44
- 2.1 针对Pax9基因探针的合成42
- 2.2 整胚原位杂交结果42-44
- 3. 讨论44-45
- 参考文献45-47
- (三) Pitx2基因在斑马鱼牙齿发育过程中的早期表达47-54
- 1.材料和方法47-50
- 2 结果50-52
- 2.1 针对Pitx2基因探针的合成50
- 2.2 整胚原位杂交结果50-52
- 3 讨论52-53
- 参考文献53-54
- (四) 淫羊藿苷对斑马鱼牙齿生长发育中钙磷沉积的影响研究54-60
- 1 材料和方法54-56
- 2. 结果56-57
- 3. 讨论57-58
- 参考文献58-60
- (五) 淫羊藿苷对体外培养的人牙龈成纤维细胞的中药干预作用研究60-64
- 1 材料和方法60-61
- 2 结果61-62
- 3 讨论62-63
- 参考文献63-64
- 全文小结64-65
- 攻读学位期间的研究成果65-66
- 附录66-81
- 致谢81-82
- 作者简介82
|
|
|
|
| 1 |
袁广明;胡黎平;李燕;陈大堤;谢富康;;成年斑马鱼石蜡连续切片的制作和苏木精-伊红染色[J];解剖学研究;2006年01期 |
| 2 |
唐志英;Wnt信号通道的分子学机制及在牙胚发育中的调控作用[J];国外医学.口腔医学分册;2002年05期 |
| 3 |
谢家敏,田卫东,汤炜,陈希哲,郑晓辉,王涛;人类牙乳头细胞的体外培养及细胞生物学性状研究[J];华西口腔医学杂志;2005年03期 |
| 4 |
王松灵;王学玖;;牙齿再生——梦想与现实[J];华西口腔医学杂志;2008年02期 |
| 5 |
李谨;王娟;沈家平;贺子义;詹瑧;;成年斑马鱼牙齿的扫描电镜观察[J];口腔医学;2009年08期 |
| 6 |
华芳;孙卫斌;葛久禹;;斑马鱼Shh、Wnt5b和Catnb特异性基因片段的克隆[J];口腔医学研究;2009年02期 |
| 7 |
王娟;徐艳;陈武;李松;马骏驰;李谨;;斑马鱼牙齿的组织结构和超微结构特征[J];口腔医学研究;2009年06期 |
| 8 |
李纾,汪说之,樊明文,杨丕山,戚向敏,王燕;人牙龈和牙周韧带成纤维细胞体外矿化能力的比较研究[J];临床口腔医学杂志;2002年05期 |
| 9 |
王娟;李谨;孙卫斌;;成年斑马鱼牙齿发育的形态学观察[J];南京医科大学学报(自然科学版);2008年07期 |
| 10 |
赵征;徐军明;;牙齿发育调控机制的研究进展[J];实用医药杂志;2009年03期 |
|
|
|
|
|
| 1 |
王晓敏,于世风,庞淑珍;阿仑膦酸盐促进体外培养鼠破骨细胞凋亡[J];北京医科大学学报;1999年05期 |
| 2 |
许永华,施新猷,胡蕴玉,刘健,顾为望,彭磊,刘丹平;牛煅烧骨与体外培养兔骨膜成骨细胞的相容性[J];第四军医大学学报;2000年04期 |
| 3 |
袁广明;胡黎平;李燕;陈大堤;谢富康;;成年斑马鱼石蜡连续切片的制作和苏木精-伊红染色[J];解剖学研究;2006年01期 |
| 4 |
李荔,张士璀,王锐,李国荣,王梅林;斑马鱼的克隆:囊胚细胞核移入正常具核卵子的发育[J];高技术通讯;2000年07期 |
| 5 |
郭敏锋;刘强;孙海飚;;成骨细胞分化调控机制研究新进展[J];国际骨科学杂志;2006年02期 |
| 6 |
唐志英;Wnt信号通道的分子学机制及在牙胚发育中的调控作用[J];国外医学.口腔医学分册;2002年05期 |
| 7 |
王跃祥,钟涛,宋后燕;斑马鱼发育遗传学研究进展[J];国外医学.遗传学分册;2004年04期 |
| 8 |
陈志信,徐香玖,黄刚,胡洁玫;骨疏康冲剂与钙剂联合应用治疗绝经后骨质疏松症的临床研究[J];中国骨肿瘤骨病;2004年01期 |
| 9 |
王英彦,马玉琴,张月敬,李心愿;用斑马鱼超弱光技术检测水体污染[J];环境科学;1992年06期 |
| 10 |
修瑞琴,高世荣,许永香,任改英;肼与苯肼对斑马鱼胚胎和仔鱼的毒性研究[J];环境科学;1992年06期 |
|
|
|
|
|
| 1 |
贾恒明;邢俊波;;正交设计优选淫羊藿中淫羊藿苷提取工艺[J];解放军药学学报;2010年03期 |
| 2 |
周兰;反相高效液相色谱法测定骨松宝颗粒中淫羊藿苷的含量[J];药物分析杂志;1998年S1期 |
| 3 |
张彤,徐莲英,俞良武;壳聚糖澄清剂对水提液中淫羊藿苷的影响[J];江西医药;2001年04期 |
| 4 |
王蕾蕾,黄海欣,孙振国;28批淫羊藿饮片质量考察[J];基层中药杂志;2001年03期 |
| 5 |
何翱,吴美珍;HPLC法测定补血养颜合剂中淫羊藿苷的含量[J];中国中药杂志;2002年06期 |
| 6 |
李先端,仝燕,于庭;益肾兴阳胶囊质量标准的研究[J];中国中药杂志;2002年11期 |
| 7 |
韩丽萍,黄清春,张延军,季波;HPLC法测定七子二仙胶囊中淫羊藿苷含量[J];解放军药学学报;2002年06期 |
| 8 |
李强,阎东海;HPLC法测定抗骨增生片中淫羊藿苷的含量[J];山东中医杂志;2003年07期 |
| 9 |
田洪根
,赵仁永
,尹华珍;RP-HPLC法测定抗骨增生丸中淫羊藿苷的含量[J];山东医药工业;2003年01期 |
| 10 |
黄瑞华,韩伟,周永传,李琰,邓修;微波辅助提取淫羊藿苷的中试研究[J];中成药;2004年07期 |
|
快捷付款方式
订购知网充值卡
订购热线
帮助中心