大黄上清液联合母乳对Caco-2炎症细胞Toll样受体及核转录因子表达的影响

【摘要】：目的：新生儿坏死性小肠结肠炎(Neonatal necrotizing enterocolitis, NEC)是由于致病菌繁殖所导致的肠缺血再灌注损伤和系统性炎症反应引起的疾病,相关的临床及实验研究已证实运用大黄及母乳喂养防治NEC有良好的效果。本实验通过运用炎症因子TNF-α诱导NEC肠道炎症细胞模型,研究大黄及母乳对Caco-2炎症细胞Toll样受体mRNA及核转录因子NF-κB P65蛋白表达的影响,探讨大黄及母乳防治NEC的相关作用机制,为其临床应用提供依据。 方法：实验分为空白对照组和TNF-α诱导模型组。空白对照组为正常培养的Caco-2细胞,然后加入常规培养液。以TNF-α成功诱导出Caco-2炎症细胞模型,采用Trans AMNF-κBp65试剂盒检测各个时间点的细胞核蛋白F-κB p65的含量,运用双荧光素酶报告系统筛选确定TNF-α最佳刺激时间点。TNF-α诱导模型组共分为四组,向TNF-α诱导模型组中分别加入常规培养液、1%的大黄上清液、1%的乳清及1%大黄上清液联合1%乳清,采用RT-PCR法检测各组细胞中Toll样受体mRNA相对表达量,采用免疫细胞化学测定NF-κB P65蛋白表达量及RT-PCR检测法测定NF-κBP65蛋白下游产物IL-1βmRNA的相对表达量,对各个组别相关检测指标水平变化的差异进行比较,分析大黄上清液、母乳及两者联合对Caco-2炎症细胞Toll样受体mRNA及NF-κBP65蛋白表达的影响。 结果：实验中研究发现：1%大黄上清液、1%母乳上清液、1%大黄上清液联合1%母乳上清液对Caco-2炎症细胞Toll样受体mRNA的相对表达量均有明显抑制作用,相对于加入常规培养液的TNF-α诱导组,P值均0.01,差异有显著统计学意义；1%大黄上清液联合1%母乳上清液组较1%大黄上清液组效果更明显,P值0.01,两组差异有显著统计学意义；1%大黄上清液联合1%母乳上清组较1%母乳上清液组作用强,差异有统计学意义(P0.05)；1%母乳上清液组较1%大黄上清液组作用强,但差异无统计学意义(P0.05)。对NF-κB P65蛋白表达,在分别加入1%大黄上清液、1%母乳上清液、1%大黄上清液联合1%母乳上清液后,较加入常规培养液的TNF-α诱导组均有明显下调,且下调程度如下：1%大黄上清液联合1%母乳上清液后组1%母乳上清液组1%大黄上清液组。1%大黄上清液、1%母乳上清液、1%大黄上清液联合1%母乳上清液对Caco-2炎症细胞NF-κB P65蛋白下游产物IL-1βmRNA的相对表达量均有明显抑制作用,相对于加入常规培养液TNF-α诱导组,P值均0.01,差异有显著统计学意义;1%大黄上清液联合1%母乳上清液组较1%大黄上清液组效果明显,P值0.01,差异有显著统计学意义；1%大黄上清液联合1%母乳上清组较1%母乳上清液组作用强,差异有统计学意义(P0.05),1%母乳上清液组较1%大黄上清液组作用强,但差异无统计学意义(P0.05)。 结论：母乳、大黄上清液及两者联合可抑制Caco-2炎症细胞Toll样受体、核转录因子NF-κBP65蛋白及其下游产物IL-1βmRNA的表达,即减轻炎症反应；说明Toll样受体、核转录因子参与了NEC的发病机制,此机制可能为母乳、大黄上清液防治NEC的作用机制之一。本研究从细胞及分子生物学水平初步阐明了大黄及母乳防止NEC的有效性及相关作用机制,进一步为临床上提倡母乳喂养及运用大黄上清液防治NEC提供了理论依据。