高血糖—糖化氧化—系膜细胞肥大和基质积聚与糖尿病肾病及其高血糖记忆的细胞病理学关系的研究

【摘要】：糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的最严重慢性并发症，是导致终末期肾功能衰竭(end-stage renal disease，ESRD)的最常见病因。病理上DN早期特征性地表现为肾脏肥大、肾小球和肾小管基底膜增厚及肾小球内高灌注、高跨膜压，随着病程的进展，可逐渐发展为肾小球系膜外基质(extra cellular matrix，ECM)进行性积聚，同时伴有肾小管-间质纤维化，最终发展为不可逆性肾组织结构毁损。 近年来有很多关于糖尿病肾病发病机制的学说，氧化应激是糖尿病肾病发病机制中的焦点。糖尿病高血糖记忆(hyperglycaemia memory)是指糖尿病患者在血糖恢复至正常后，病情得不到控制，仍进行性发展，一些特征性表现如肾小球基底膜增厚进展、持续发展呈明显的惯性式的恶化，这些都提示在有限时间内代谢的紊乱可以导致长期持续的后果。本研究共分六部分，以牛肾小球系膜细胞为材料，研究氧化应激和糖化反应在糖尿病肾病及其高血糖记忆发病中的作用，以及中药胡黄连对糖尿病肾病及高血糖记忆的抑制作用。 第一部分说明了糖化和氧化应激在糖尿病肾病发病中的作用，理论上提出“高血糖记忆”可能与糖化氧化有关的假说。第二部分研究了高糖和AGEs对系膜细胞增殖的影响，结果表明高糖和AGEs作用于系膜细胞4天后表现为系膜细胞增殖抑制，系膜细胞肥大，细胞周期停滞于G_1期，且分泌细胞外基质增多。提示高糖和AGEs作用相似，说明一旦糖化蛋白(AGEs)形成，即使在血糖控制正常水平条件下，AGEs同样可以引起病变，AGEs与高血糖记忆的关系可以确立。 本文第三部分采用系膜细胞长期培养的方法，研究了“高血糖—糖化氧化—系膜细胞肥大、基质积聚”链式病理反应与糖尿病肾病的关系。氨基胍和抗氧化剂CAT和DMSO可以抑制长期高糖培养引起系膜细胞肥大和细胞分泌胶原的增高，进一步研究表明，长期高糖培养的系膜细胞内多元醇通路激活，山梨醇含量增高，细胞内AGEs含量也明显升高，说明高糖作用下细胞内糖代谢紊乱，而抗氧化剂和氨基胍可以抑制细胞内山梨醇和AGEs含量的升高。提示糖代 志血铃一铃化乘化一系肚佃跳肥大和基质积徐与幼尿病呀病蔽其龙血铂记忆的佃脸病理哮关系的研究 谢紊乱和氧化应激有关。长期高糖培养下系膜细胞内ROS升高，细胞内游离钙 离子浓度增高，同时线粒体膜电位降低，说明在高糖作用下存在明显的氧化应 激，氨基肌和抗氧化剂对氧化应激起保护作用。以上结果提示糖尿病状态下由 于糖代谢紊乱产生ROS，使机体处于氧化应激状态，同时氧化应激有加重糖化 反应，糖化和氧化关系密切，糖化氧化在糖尿病的发病中起关键作用，为药理 学研究提供依据。 第四部分研究了糖化氧化在糖尿病肾病高血糖记忆发病中的作用。采用模 拟高血糖记忆，即将系膜细胞在长期高糖培养(3周)。然后，恢复正常血糖水 平，观察细胞形态的变化。研究发现，恢复正常血糖水平之后，系膜细胞与胞 外基质的病变仍进一步演变，仍表现为细胞肥大、分泌细胞外基质增多。伴随 着系膜细胞和基质病变演变的同时，糖浓度恢复正常后8天，细胞内ROS持续 升高，线粒体膜损伤仍持续存在，细胞内AGES增多。表明尽管高糖因素已经 撤除，而由高糖诱发的糖化氧化的因素持续存在。氨基肌和抗氧剂DMSO和CAT 能减轻病变，降低细胞内ROS，保护线粒体损伤，抑制细胞内AGEs的升高， 反证了糖尿病高血糖记忆是由氧化应激恶化引起的，而氧化应激又和糖化反应 关系密切。那么，氧化应激本身是否能形成系膜细胞肥大与基质集聚呢?如果 是系膜细胞肥大与基质集聚是氧化应激结果，而与高糖的诱发无必然的联系， 因为多种病理因素可以诱发氧化应激。我们以过氧化氢刺激细胞损伤为模型研 究了单纯氧化应激损伤对系膜细胞的影响。结果表明长期低浓度过氧化氢刺激 系膜细胞，在去除刺激因素后ROS逐渐降低，说明高血糖记忆不是单纯由氧化 应激引起的，而是由于糖浓度恢复正常后引起了氧化应激恶化，而氧化应激又 加重了糖化反应，形成了恶性循环，因此高血糖记忆是由糖化氧化引起的，高 糖一糖化氧化一系膜细胞肥大/基质集聚为特征的病理链，是糖尿病并发症的 特有现象。 第五部分研究了氧化应激对体外蛋白质非酶糖基化反应的作用以及中药胡 黄连的作用。以葡萄糖和牛血清白蛋白共同在37℃条件下孵育建立体外蛋白质 非酶糖基化反应体系，在糖化反应体系中加入不同浓度的珑。:来激发ROS，研 究Ros对蛋白质非酶糖基化反应的影响;以及氨基呱、抗氧化剂和中药胡黄连 对体外孵育蛋白非酶糖基化系统的影响。结果显示HZO:可促进蛋白质非酶糖基 龙血拍一确化长化一系腆佃胞肚大和基质积聚与确尿病呀病践其离血确亿忆的佃胞病理诊关系的研究 化反应，氨基肌、抗氧化剂和中药胡黄连可抑制体外非酶糖基化反应，说明在 细胞水平和整体水平氧化和糖化通过各种体经相互联系，它们之间的关系是密 不可分厂的，用抗氧化剂来抑制AGES的形成为治疗糖尿病并发症提供了新思路， 也支持了我们前面的观点，而中药胡黄连则可作为抗氧化剂治疗糖尿病肾病。 因此在本研究的第六部分我们研究了中药胡黄连对糖尿病肾病和高血糖记 忆的作

【关键词】：糖尿病肾病 高血糖记忆 氧化应激 活性氧 非酶糖基化反应 糖化氧化
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R587.1;R285
【目录】：