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《南京师范大学》 2014年
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链霉菌表达载体的构建和阿霉素生物合成基因簇大片段的克隆

王瑞青  
【摘要】:许多具有基础研究和应用价值的多肽或蛋白质,在天然生物中含量都很低。因此对这些物质的性质及其活性的深入研究,以及对它们进行开发和应用就受到了一定的限制。应用基因工程技术,这些多肽和蛋白质的基因能被有效地克隆到各种各样的基因表达载体上,从而在诸如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、链霉菌(Streptomycetaceae)、酵母菌(Yeast)、动物和植物等生物中进行超量表达。近年来DNA体外重组、基因克隆、定点突变、碱基序列分析等分子生物学技术已广泛应用于链霉菌的遗传学研究,链霉菌的质粒载体、噬菌体载体、以及链霉菌的受体系统等都有很大发展,适合链霉菌转化技术已经很成熟,这些都为深入研究链霉菌创造了有利条件。基于以上条件,本研究构建了含有大肠杆菌复制子(pIJ101 ori)、强启动子(PtipA)、组氨酸标签(6xHis tag)、TEV蛋白酶切位点的表达载体以及不含有组氨酸标签的表达载体。其中大肠杆菌复制子可使基因在大肠杆菌中克隆表达;硫链丝菌素抗性基因(tsr)以筛选正确克隆;依赖硫链丝菌素诱导表达强启动子(PtipA),它具有严谨的关闭性与开放性,使其成为构建链霉菌表达载体中最有价值的启动子之一。这两种链霉菌表达载体,其中含有组氨酸标签(6xHis tag)和TEV蛋白酶切位点的表达载体,可以通过Ni-NTA亲和层析法分离纯化蛋白,并且也可通过TEV酶切位点酶切分离出表达的蛋白。不含有组氨酸标签和TEV蛋白酶切位点的表达载体,为后续蛋白表达提供更多选择,有利于基因的克隆。阿霉素对多种肿瘤均有作用,属周期非特异性药物,对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。抗瘤谱较广,对机体可产生广泛的生物化学效应,成为目前临床上应用最广泛的抗肿瘤药物之一。目前阿霉素主要是通过化学半合成法合成。一般是通过柔红霉素经过复杂的化学合成反应而得到。利用此法合成阿霉素有很多优势,但是也存在很多不足,消耗大量的有机溶剂、造成环境污染、产率一般比较低。所以设想构建微生物表达载体,异源表达直接生产阿霉素。本研究主要通过PCR技术从链霉菌基因组上扩增出所需目的基因小片段,并分步将PCR扩增出来目的基因小片段的拼接,成为目的基因大片段,最后拼接成完整的表达载体。这种程序虽然繁琐、复杂、并耗费一定的时间和人力、物力,但是可以降低成本,简化生产流程,减少污染,并带来一定的社会效益和经济效益。
【学位授予单位】:南京师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:Q78

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