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《南京师范大学》 2011年
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生物质降解相关酶基因重组和高效表达技术的研究

彭静静  
【摘要】:纤维素和半纤维素是地球上最丰富的可再生性生物质资源,它们的降解、转化是自然界中碳素转化的主要环节,来源于嗜热菌中的生物质降解酶具有较高的热稳定性和催化效率,能够很好的满足工业化生产的需要。大肠杆菌具有繁殖迅速,培养简单,遗传背景清楚,基因克隆表达系统成熟完善等优点,是人们表达重组酶的第一选择。但是,外源蛋白在大肠杆菌中高效表达时容易形成包涵体。pHsh系统作为新型大肠杆菌表达系统,pHsh载体包含一个根据σ32所专门识别的热休克蛋白基因启动子的保守序列设计并合成的热激启动子,外源基因在热激启动子的控制下,通过提高温度来诱导外源基因表达。来源于疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus DSM 5826)的木聚糖酶A(xynA)使用热激分泌表达载体pHsh-ex已在大肠杆菌中实现了木聚糖酶的高效可溶性表达,解决了原来形成包涵体的问题。在此基础上,本研究以热纤梭菌(Clostridium thermocellum ATCC 27405 )来源的纤维素酶为研究对象,采用热激表达载体pHsh在大肠杆菌中实现高效表达,并且实现了纤维素酶的可溶性表达,并通过基因定点突变的方式提高其在大肠杆菌中的表达水平。以嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus JW200)双活性木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶(xarB)和疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus DSM 5826)来源的木聚糖酶A(xynA)作为基因源构建了降解半纤维素的多功能融合酶,并对融合酶(XarB-XynA)的酶学性质和释放还原糖的酶解效率进行了研究,并且发现该融合酶形成包涵体,利用热激表达载体pHsh系统探讨解决融合酶(XarB-XynA)的可溶性表达问题。1.将来源于热纤梭菌(C.thermocellum)的纤维素酶(celD)分别构建到pHsh和pET两个表达系统,发现目的蛋白在pET系统表达时形成包涵体,采用热激表达系统体pHsh在大肠杆菌表达时实现了纤维素酶的可溶性表达。结合DNA分析软件,分别对mRNA二级结构和密码子进行了优化,优化后的酶活(6.4±0.4U ml-1)是未优化的1.6倍(4.1±0.3 Uml-1)。纯化的纤维素酶的最适反应pH为5.4,在不同的pH条件下60℃保温30min,重组纤维素酶在5.4~7.8的pH范围内比较稳定,在70℃下酶的半衰期约为1 h,Ca2+可以增强酶活,而EDTA则会抑制酶的活性。2.以嗜热厌氧乙醇杆菌(T.ethanolicus JW200)双活性木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶(XarB)和来源于疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosusDSM 5826)木聚糖酶A(XynA)为基因源构建的三功能融合蛋白(XarB-XynA),进而研究各个单酶和融合酶的酶学性质。纯化后分析融合酶和游离酶的酶学性质,数据显示:融合酶的三种酶学性质融合前后最适温度、最适pH基本没变化,仅有其α-阿拉伯糖苷酶的最适温度些许差异,同时其pH稳定性和木聚糖酶活性的热稳定性比游离酶高。在融合酶的两个催化结构域间插入连接肽Linker,进而得到带有Linker质粒的pET-20b-xar-s-xynA,通过酶解燕麦木聚糖和麦麸实验发现,带有Linker肽的融合酶能够增强三功能酶从麸皮释放还原糖的效率。3.来源于 T. lanuginosus DSM 5826 木聚糖酶 A(xynA)和来源于 T. ehanolicus JW200的双活性木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶(xarB)构建了融合蛋白,但在大肠杆菌表达时形成包涵体。为了进一步探讨木聚糖酶A哪部分基因编码的蛋白导致形成包涵体,我们将木聚糖酶A拆分成两部分分别于双活性木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶(xarB)进行基因融合,结果发现,仅仅融合木聚糖酶(XynA)N端99个或者是C端的97个氨基酸,融合后的蛋白绝大部分都会以包涵体形式存在。通过构建质粒pHsh-ex-xarB-xynA,采用热激分泌表达方式提高了可溶性表达水平。同时也探讨了大肠杆菌K12来源的N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶(argE)和来源于人的人纤溶酶原激活抑制剂II和绿色荧光蛋白的融合基因(pai2-egfp)的表达,采用热激表达载体pHsh在大肠杆菌中提高可溶性表达水平。
【学位授予单位】:南京师范大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q78;Q55

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