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《南京师范大学》 2018年
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基于TiO_2—多孔硅的蛋白质芯片技术检测谷物中的多元真菌毒素

蔡婷婷  
【摘要】:食物中真菌毒素的污染一直是全球关注的问题。真菌毒素是由一些丝状真菌产生的有毒次级代谢产物,在低浓度下就会导致人和动物患病。它们的作用范围包括细胞毒性,肾毒性,肝毒性,致畸性,致突变,致癌和免疫抑制。而且饲料及食物中往往存在多种真菌毒素,危害更大。一般通过色谱法、免疫测定或传感器检测真菌毒素。色谱法虽然具有较高的灵敏度和准确性,但成本高、分析时间长、样品处理繁琐和对技术人员要求较高,使其存在一定的局限性。而多孔硅比表面积大,结合位点多,应用于检测真菌毒素时,样品处理简便。因此,本文以多孔硅为载体,以免疫分析为基础,建立一种蛋白质芯片技术来检测谷物中的多元真菌毒素。本文以P型单晶硅为材料,通过电化学刻蚀法制备多孔硅。首先对刻蚀的波形进行了选择,确定为方波刻蚀。然后,为了增加多孔硅的稳定性,在表面旋涂了一层TiO2,对比了涂Ti02前后硅片与蛋白质的结合能力。并分别用醛基、羧基和环氧基修饰多孔硅,结果表明用环氧基修饰的效果更好。接着分别优化了 OTA、AFB1和FB1的完全抗原、一抗和荧光二抗(Cy3-IgG)的浓度,最终确定OTA-BSA、AFB1-BSA和FB1-BSA的浓度依次为200、100和200μg/mL,OTA-Ab、AFBi-AbFBi-Ab 的浓度依次为 200、100、200Oμg/mL,对应荧光二抗的浓度均为60μg/mL。并根据优化的条件制作了三种真菌毒素的标准曲线,其中OTA的检测线性范围为0.01-10 ng/mL,线性方程为y=-1576.3675 log(x)+8761.3079,R2 = 0.999,检测限为 32.6 pg/mL;AFBi 的检测线性范围为 0.001-1 ng/mL,线性方程为 y=-1584.1929 log(x)+6743.3798,R2 = 0.985,检测限为 0.314 ng/mL;FB1的检测线性范围为 0.01-10 ng/mL,线性方程为 y=-1187.7643 log(x)+9179.6908,R2 =0.992,检测限为0.197 ng/mL。该方法的批内精密度RSD为11%以下,批间精密度为13%以下。另外,以OTA为例对特异性进行了分析,结果表明,该方法对OTA有良好的特异性,与其结构类似物OTB之间没有明显的交叉反应。并分别用本方法和ELISA方法测定了大米、小麦和玉米中OTA的加标回收率,用本法测定的9个样品中有7个样品回收率在80-120%之间,与用ELISA方法测定的回收率基本一致,说明本法用于检测谷物中的真菌毒素具有可行性。在建立的检测单种真菌毒素方法的基础上,根据最优反应条件,建立了同时检测多元真菌毒素的方法,对比了两种不同的混合反应体系对检测结果的影响。结果表明,将混合真菌毒素分别和抗体混合的方式测得的标准曲线线性范围更广,达2-3个数量级。该方法同时检测OTA、AFB1、FB1的线性检测范围依次为0.01-1、0.001-1、0.01-1 ng/mL。并对多重特异性进行了分析,结果表明抗原抗体特异性较好。然后,分别用本法和ELISA方法测定了 OTA、AFB1和FB1混合真菌毒素在大米、玉米和小麦中的加标回收率,结果表明,两种方法测定的回收率基本一致,说明本章建立的同时检测多元真菌毒素方法应用于谷物中多元真菌毒素的检测具有可行性。
【学位授予单位】:南京师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:TS210.7

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