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《南京师范大学》 2019年
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萼花臂尾轮虫衰老过程中体内相关基因活化特征及其分子机制研究

田间  
【摘要】:轮虫动物门(Phylum Rotifera)分为尾盘纲(Seisona)、双巢纲(Digononta)和单巢纲(Monogononta)。单巢纲轮虫生活史具有世代交替现象,在适宜环境条件下行孤雌生殖,非混交雌体(Amictic-female)产生非需精卵,不需受精,直接萌发成子代非混交雌体,使种群迅速繁衍。环境条件恶劣时,种群出现混交雌体(Mictic-female),进入有性生殖阶段。混交雌体的卵不受精时直接萌发为雄体,雄体与混交雌体交配,产生休眠卵,进入育期。轮虫在孤雌生殖阶段,母体性成熟后,通常携带1-3个非需精卵,4日龄开始进入衰老期。其衰老特征主要表现为:游泳速度迟缓、沉底贴壁、体壁几丁质增厚、消化道空瘪、个体的后棘刺显著加长。由于轮虫与线虫结构特征具有诸多相似之处(如,体壁具有角质层、个体体细胞数量恒定和具有初生体腔),过去曾被归为线虫动物门(Phylum Nematoda)轮虫纲(Rotifer)。现行的动物分类系统把轮虫另立为轮虫动物门,与线虫动物门等具另外七个具有初生体腔的动物一起,被列入假体腔动物(Pseudocoelomata)类。随着分子生物学研究新技术的发展和应用,目前国际同行已开始尝试利用轮虫为试验材料,开展热休克蛋白参与衰老相关信号通路的调控,以期揭示轮虫是否通过调节HSP70参与的相关信号通路来延长其寿命。目前,轮虫(Adineta vaga)基因组以及与轮虫具有类似生活史和生殖模式的枝角类(Daphnia pulex)基因组已经公布,热休克蛋白活性特征及其通过相关信号通路的调控,影响轮虫衰老的研究逐渐引起人们的关注。轮虫分布广泛、个体微小、繁殖速度快、易于培养、寿命周期短,可以在μL容积中培养观察,实验操作简便。加上利用休眠卵萌发的个体,建立源于单个轮虫来源的品系的方法简便、能在短时间内获得生理特性较为一致性的健康个体,能最大限度的减少实验材料带来的实验误差。所以,轮虫和线虫一样,是衰老生物学研究的理想受试动物。相关研究发现,萼花臂尾轮虫通过诱导产生的MnSOD和CAT对延缓轮虫的衰老起着重要的作用,其作用效果比在线虫中作用更显著。,其作用效果比在线虫中作用更显著。基于轮虫开展的衰老生物学研究成果,为动物衰老机理研究的相关理论(如,自由基理论(Free radical theory of aging))的发展做出了巨大贡献。基于轮虫开展的衰老生物学研究成果,为动物衰老机理研究的相关理论的发展做出了巨大贡献。本文研究结果主要包括以下6个方面:1.槲皮素对轮虫寿命、生殖以及抗氧化性研究本章实验结果表明:适当浓度槲皮素(20μM)对萼花臂尾轮虫的寿命有着显著影响,而高浓度槲皮素(50μM)表现出对轮虫的急性毒理效应,严重干扰其生殖。在20μM槲皮素中培养的轮虫的寿命显著高于对照组(15%)。此外,MnSOD和CAT的mRNA表达量也显著增加。在高温环境(35°C)产生的氧化压力下,槲皮素处理能够降低轮虫体内ROS含量,并增加轮虫的存活率。本结论强调了槲皮素主要通过改善轮虫机体的抗氧化能力来延长轮虫寿命。2.基于RNAi技术揭示SIR2基因在调控轮虫寿命的作用机理本章实验结果表明:20μM槲皮素处理组与12CR处理组轮虫SIR2基因表达量在处理36h时显著高于对照组(P0.05)。当对SIR2基因进行干扰后,槲皮素、饮食限制处理组轮虫平均寿命与对照组相比无显著性差异(P0.05)。这表明SIR2基因参与了轮虫由饮食限制、抗氧化剂所激发的代谢通路,并起到了延长轮虫寿命的作用。我们的研究结果首次确立了SIR2活性在调节轮虫寿命方面的作用。随着轮虫成为研究衰老的模式生物,萼花臂尾轮虫SIR2基因作用机制分析将得到进一步的完善。3.低温延长轮虫寿命的热力学效应和基因调控研究通过本章节实验,我们发现当培养温度为20°C和15°C时,平均寿命分别为170.5±12.5 h和13.6±8.6 h,显著高于25°C对照组(102.2±7.4 h),并且20°C处理组轮虫在急性氧化条件下的存活率也要显著高于对照组(P0.05)。这表明低温延长萼花臂尾轮虫的寿命并不是被动的完全受温度调控的,在轮虫生命初始,低温环境可能调节了特定基因的表达。由于低温导致轮虫寿命延长这一效果具有持续性,即使在第四天将轮虫移入25°C培养,轮虫平均寿命也要显著高于对照组(P0.05)。RNA干扰实验中,我们发现进行基因干扰后,低温对轮虫寿命延长效果下降,但仍然显著高于对照组轮虫平均寿命(P0.05)。这说明在低温导致轮虫寿命延长的现象中,基因调控要比热力学效应发挥更大的作用。4.在轮虫衰老过程中钙稳态的相关研究本章实验结果表明:萼花臂尾轮虫SERCA基因表达量会随着轮虫衰老程度的增加而降低。硝苯地平阻止了钙离子进入轮虫细胞,显著减少了轮虫在第5日时体内钙离子和丙二醛的含量(P0.05),同时显著延长了轮虫的寿命(对照组平均寿命为99.5±16.5 h,0.5μM硝苯地平处理组为125.8±12.9 h,P0.05)。这些实验结果表明钙离子在轮虫衰老过程尤其在生命后期中起着十分关键的作用,并且由这种钙稳态导致的细胞损伤是可以通过添加药物处理来改善的。5.亲代不同温度经历对子代耐受性的影响本章实验中我们检测了萼花臂尾轮虫两种母体效应(母代生殖年龄和母代不同食物喂养方案)对后代的影响。我们发现母代的年龄影响了后代寿命,体型的大小,并且母代进行饮食限制后可以在一定程度上降低一些负面影响。当CR处理组子代同样进行CR处理时,子代平均寿命显著高于母。CR实验组所产第三个子代平均寿命显著高于AL对照组所产第三个子代平均寿命,这说明对母代进行适当的饮食限制可以降低生育年龄对子代的不利影响。6.不同年龄组轮虫处于高浓度CO_2条件下,寿命长短、压力防御基因的表达量变化分析本章实验结果表明,水体酸化对B.calyciflorus种群增长率和平均产卵量均显著低于对照组(P0.05)。虽然实验组轮虫生殖前期与对照组无显著差别,但净生殖率却因水体酸化而显著降低。我们发现在不同年龄组轮虫中,过氧化氢酶CAT和热休克蛋白HSP70基因的mRNA表达受水体酸化影响,且表达量显著高于对照组(P0.05);相同年龄组不同处理条件下的mRNA表达量与对照组相比也有显著差别。本章实验揭示了当轮虫受到酸化水体影响时,种群的年龄结构是一个很重要的参与因素,因为年龄结构可能会改变能量的重新分配和生物对环境的耐受性。
【学位授予单位】:南京师范大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:Q953

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