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《南京师范大学》 2019年
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暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)应对低温胁迫的生理响应和分子机制研究

文鑫  
【摘要】:本论文以暗纹东方鲀为研究对象,首先运用转录组学、蛋白质组学、代谢组学等高通量测序的方法对低温胁迫下暗纹东方鲀的应答机制进行研究;随后在此基础上,进一步探讨盐度对暗纹东方鲀在低温环境下的肝功能、免疫、氧化应激、脂代谢、p38MAPK、凋亡、存活等方面的影响。以期在分子水平上系统阐明暗纹东方鲀应对低温胁迫的分子调控机制,同时为暗纹东方鲀的安全越冬提供一定的理论依据。本论文的主要研究结果如下:1.多组学联合分析暗纹东方应对低温胁迫的分子机制在转录水平,总共有5166个差异基因被发现,其中包含2544个上调和2622个下调基因。对这些差异基因进行GO富集分析发现,暗纹东方鲀应对低温胁迫所调控的基因主要聚集在binding,ion binding,intracellular,intracellular part,cellular response to DNA damage stimulus,macromolecule catabolic process等生物学GO簇。此外,通过KEGG的分析,暗纹东方鲀肝脏的一些重要的通路参与了低温胁迫的调控,例如ibosome biogenesis in eukaryotes,glyoxylate and dicarboxylate metabolism,RNA transport,PPAR signaling pathway,fatty acid biosynthesis。在翻译水平,基于iTRAQ蛋白质组学技术鉴定了3741个蛋白,包含160个差异蛋白,其中53个上调和107个下调的蛋白。随后,通过qRT-PCR验证HSP90、CIRB、GST、RAP1A、ERBB2、FLNB、RPS6KA、DAAO、COX5A、A2ML1、CAB 39等11个基因;PRM验证HSP90、CIRB、GST、FLNB、A2ML1等蛋白的丰度,证实了数据的可靠性和可重复性。通过分析,KEGG富集到了MAPK和Wnt两个信号转导相关的通路。根据分析的结果,将这些蛋白聚焦到三个主要的小组,分别是造成损伤的氧化应激(9个蛋白HSP90、CIRP、CSDE1、DAAO、GST、ZIP7、RDH12、TFRC1、QSOX1)、与运输相关的线粒体酶(11个蛋白:PRODH、TOMM20、OAT、Ucp1、C8G、COX5A、ATP5J、GATA、MPC1、PNPT1、THRS)、以及信号转导(13个蛋白:RAP1A、ERBB2、FLNB、RAC1、RPS6KA、CAB39、CSNK1A、IMPA1、MTM14、PIK3、G protein、PLCB、CACYBP)。在代谢水平,基于HILIC UHPLC-Q-TOF MS技术的代谢组学方法进行代谢轮廓的变化分析。QC样本谱图比对、主成分(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)的实验表明,本次实验的仪器分析系统稳定性较好,试验数据稳定可靠,在实验中获得的代谢谱差异能反映样本间自身的生物学差异。总共有4085个阳离子峰和5379个阴离子峰被鉴定。经进一步鉴定,共筛选到40个差异代谢物,其中9个下调和31个上调。将差异代谢物所参与的调控通路整合分析发现,脂类代谢类别的通路以及参与这些通路的差异代谢物最多,这说明脂类代谢在暗纹东方鲀应对低温胁迫时发挥了关键作用。联合转录-蛋白-代谢的多组学分析发现,暗纹东方鲀低温耐受机制聚焦到20条通路,其中有14个上调和3个下调的差异代谢物,8个上调和3个下调以及3个相反趋势的基因参与了这些通路。将这些差异代谢物和差异共表达基因进行相关性整合发现,它们的互作关系主要分为了两支,一支主要以胆汁盐(bile salts)的跨膜运输为主,而另一只主要以不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acids),维生素(vitamins)、腺苷(adenosine)为主。说明暗纹东方鲀主要通过增强不饱和脂肪酸的代谢,胆汁盐的运输,维生素摄取和抗氧化能力来实现低温耐受调控。此外,对多组学联合分析得到具有一致趋势的11个差异基因进行SNP预测,总共有23个潜在的SNPs位点被检测到。通过对50尾个体暗纹东方鲀的DNA进行SNP位点验证,总共有13个SNP位点呈现阳性,预期可作为暗纹东方鲀耐寒性状的分子标记。2.低温下盐度对暗纹东方鲀生理生化的影响多组学联合分析的研究发现,低温会影响信号转导、氧化应激、线粒体酶等相关基因和蛋白的表达,进而阻碍肝脏的正常代谢,改变氧化应激水平、脂质代谢水平、免疫系统。进一步研究发现,添加适宜的盐度后,能够有效缓解低温带来的压力。具体表现在:(1)降低氧化应激水平。在13℃和17℃下,添加10ppt的盐能够显著降低Cortisol、GSH-PX、MDA的浓度以及HSP90基因和蛋白的表达。(2)缓解脂质代谢程度。10ppt盐度的刺激能使T-CHO在13℃和17℃都显著上调。相反的,GLU和TG则呈现上调的趋势,并且在13或17℃时,添加10ppt盐后都使得它们含量下调。(3)改变相关免疫系统,如ALT、AST、IgM、LZM的活性,Gran、RBC、LYMPH的数量,以及IFN、IFNR、IL-4、IL-4R的表达在低温和盐度的综合作用下,都发生了显著的改变。(4)改变p38MAPK及其磷酸化蛋白的表达,以及p38MAPK下游转录因子ATF2、ElK-1、MEF2、P53基因的表达。这些基因和蛋白的变化相应的改变了不同处理下的暗纹东方鲀存活率以及肝脏细胞的凋亡指数。13℃和17℃时,盐度10ppt处理组出现死亡的时间均比0ppt和20ppt延迟。在13℃下,10盐度相对于0盐度处理能够明显减少死亡率,且随着处理时间的增加更为显著。相似的,0ppt和10ppt的盐度下,凋亡水平都会随着温度的下降而升高。并且盐度10ppt在13℃和17℃条件下,相对于盐度0ppt和20ppt,能够显著降低凋亡水平。21℃时三种盐度都无法显著改变凋亡水平。2025(20ppt,25℃)的处理则呈现高凋亡水平。这些结果表明,盐度与低温之间存在调节暗纹东方鲀生理平衡的机制。
【学位授予单位】:南京师范大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:S917.4

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