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《南京师范大学》 2003年
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中华绒螯蟹卵巢发育相关基因的研究

马长艳  
【摘要】: 第一部分 中华绒螯蟹卵巢发育相关基因的筛选 1 中华绒螯蟹卵巢差减cDNA文库的构建 应用抑制性差减杂交技术,构建了中华绒螯蟹卵巢两个发育时期的差减cDNA文库。其中以Ⅲ期卵巢为试验方(tester),Ⅱ期卵巢为驱动方(driver)进行正向差减杂交;以Ⅱ期卵巢为试验方,Ⅲ期卵巢为驱动方进行反向差减杂交。分别将所获差减cDNA片段插入质粒表达载体(PinPoint Xa-1 T-Vector),转化大肠杆菌JM109。最后所获正向差减文库含863个重组子,反向差减文库含360个重组子。PCR扩增鉴定正、反向差减cDNA文库的插入片段平均大小分别为360bp和160bp,表明所构建的差减文库适合进一步研究中华绒螯蟹卵巢发育相关基因。 2 用cDNA微阵列筛选中华绒螯蟹卵巢发育相关基因 将差减cDNA文库中的所有克隆用碱裂解法提取质粒,然后以提取的质粒为模板,用PCR方法扩增插入片段。PCR产物经浓缩、变性处理后,用自动点样仪点制于尼龙膜载体上,制成cDNA微阵列。分别将中华绒螯蟹Ⅱ期和Ⅲ期卵巢的mRNA反转录标记成~(33)P探针,然后将2种探针分别与2张相同的膜杂交,经洗膜、压片和放射自显影后进行信号的扫描和分析。结果共获得2倍以上差异表达克隆167个。其中Ⅲ期高表达克隆104个,Ⅱ期高表达克隆63个。 3 中华绒螯蟹卵巢发育相关基因cDNA片段的序列测定 从cDNA微阵列筛选的差异表达克隆中选取部分克隆进行测序。结果正向差减文库中获得7个独立的EST。同源性分析结果表明,这些EST皆为新的EST,已被dbEST收录,检索号分别为:CA591892、CA591893、CA591894、CA591895、CA591896、CA591897和CA591898。 南京师范大学博士研究生毕业论文 第二部分 中华绒螫蟹卵巢发育相关基因全长叨*A的克隆及序列分析 工 中华绒蟹蟹卵巢RA*kC**A文库的构建 为了获得差异表达基因的全长CDNA序列,运用SMART技术,构建了中 华绒蟹蟹卵巢(ill期)RACE CDNA文库。琼脂糖凝胶电泳结果表明,文库所 含全长 CDNA的长度主要集中在 500~2 000 hp之间,RACE PCR结果表明,所 用基因特异性引物与接头引物皆能扩增出产物,说明构建的文库质量较好,适 于用RACE方法从中分离中华绒螫蟹卵巢发育相关基因的全长。DNA。 二中华绒螫蟹卵巢发育相关基因E*0且的全长CO*A克隆和序列分析 根据SSH结合CDNA微阵列技术获得的EST004*bEST检索号:CA591895) 的序列设计引物,分别用 5’RACE和 3RACE的方法获得了 EJO基因的全长 cDNA序列。同时用生物信息学的方法对 EJO基因的结构和功能进行了初步分 析;用RTPCR的方法对该基因的表达谱进行了研究;用NOrtheffi印迹分析的 方法对该基因在*期和*期卵巢的表达差异性进行了进一步验证。结果表明获 得的EJOI基因的CDNA长度为876 hp,开放阅读框长度为759 hp,编码252 个氨基酸。由氨基酸序列推断的 EJO基因编码蛋白的等电点为 6.18,分子量为 28.18 kDa石wissProt数据库中未发现与 EJOI基因编码蛋白有意义的匹配序列。 新基因 EJO编码的蛋白可能为分泌蛋白,前 17个氨基酸为信号肽。EJO基因 在中华绒赘蟹的心脏、肠和卵巢中皆有表达,而在肌肉和肝胰腺中未见表达。 Northern印迹分析结果表明EJOI基因在m期卵巢高表达。EJOI基因的GenBank 检索号为:AY185917。 3中华城螫蟹卵巢发育相关基因EJ 03的全长0*A克隆和序列分析 根据SSH结合CDNA微阵列技术获得的EST003(dbEST检索号:CA591894) 的序列设计引物,用5’RACE和3’RACE的方法获得了EJO3基因的全长cDNA 序列。同时用生物信息学的方法对EJO3基因的结构和功能进行了初步分析;用 RTPCR的方法对该基因的表达谱进行了研究;用N。them印迹分析的方法对该 基因在*期和皿期卵巢的表达差异性进行了进一步验证。结果表明获得的EJO3 基因的 CDNA长度为 1514 hp,开放阅读框长度为 1368 hp,编码 456个氨基酸。 由氨基酸序列推断的 EJO3基因编码蛋白的等电点为 5.79,分子量为 50刀0 ica。 SwissProt数据库中未发现与EJO3基因编码蛋白有显著性意义的匹配序列。新 基因EJO3编码的蛋白可能为分泌蛋白,前20个氨基酸为信号肽。EJO3基因主 要存在2个转录本,其中较大的转录本除了在中华绒资蟹卵巢中表达外,在肠 3 南京师范大学博士研究生毕业论文 中也有弱表达,而在心脏、肌肉和肝胰腺中未见表达;较小的转录本在所研究 的组织中皆有表达。此外,在肌肉组织中除了存在较小的转录本外,还有2个 较弱的转录本。Nonilern印迹分析结果表明EJO3基因在*期卵巢高表达。EJO3 基因的GenBank检索号为:AY185919。
【学位授予单位】:南京师范大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q953

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 吴萍;日本沼虾卵巢表达序列标签分析及生殖相关基因的克隆与表达[D];华东师范大学;2009年
2 张伟;中华绒螯蟹精巢组织cDNA文库构建和Dmcl基因的克隆与序列分析[D];华东师范大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 陆钟岩;中华绒螯蟹卵巢新基因EJO1的表达研究[D];南京师范大学;2006年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 宋霞,周开亚;甲壳类的眼柄神经激素[J];动物学杂志;2000年04期
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3 褚衍亮,姜乃澄,王玥;甲壳动物神经肽的结构和功能[J];东海海洋;2002年01期
4 马长艳,周开亚,郭豫杰,王义权,赵乃刚,汪朝晖;中华绒螯蟹卵巢差减cDNA文库的构建[J];动物学研究;2003年01期
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【共引文献】
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6 孟宪萍;李晓晓;李雅轩;蔡民华;胡英考;;日本百脉根γ-生育酚甲基转移酶基因的电子克隆及进化分析[J];安徽农业科学;2006年24期
7 朱德艳;;浅析RNAi技术的应用及发展前景[J];安徽农业科学;2007年24期
8 郑阳霞;李焕秀;严泽生;;RACE技术及其在植物基因研究中的应用[J];安徽农业科学;2008年07期
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10 杨辉;彭正松;杨在君;冯晓;陈真勇;;小麦TP突变体幼苗在光胁迫条件下的基因表达差异[J];安徽农业科学;2010年07期
中国重要会议论文全文数据库 前6条
1 马群群;马洪雨;马凌波;马春艳;崔海玉;;拟穴青蟹线粒体COI基因序列克隆及SNPs位点筛选[A];经济发展方式转变与自主创新——第十二届中国科学技术协会年会(第三卷)[C];2010年
2 郭晓红;周忠孝;吴明煜;;RNA干涉的分子机制及技术研究进展[A];中国生理学会论文汇编2005年第一期[C];2005年
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4 赵彦;云锦凤;石凤敏;刘亚玲;王俊杰;张众;;蒙古冰草LEA3基因RNAi表达载体的构建[A];中国草学会牧草育种委员会第七届代表大会论文集[C];2009年
5 刘菊华;金志强;徐碧玉;;植物功能基因组学研究技术及其在热带作物上的应用前景[A];中国热带作物学会第七次全国会员代表大会暨学术讨论会论文集[C];2004年
6 霍海如;谭余庆;周爱香;李小芹;郭淑英;孙玉茹;姜廷良;;桂枝汤有效部位A对下丘脑热休克蛋白含量的影响[A];2000中药研究论文集[C];2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 冯政夫;栉孔扇贝Cf-dmrt4-like基因的克隆、表达及功能分析[D];中国海洋大学;2010年
2 张凤英;日本沼虾(Macrobrachium nipponense)卵子和胚胎发育相关基因的克隆与表达研究[D];华东师范大学;2011年
3 许光辉;基于基因芯片技术的刺五加改善果蝇睡眠作用的机制研究[D];黑龙江中医药大学;2010年
4 郭新军;拟黑多刺蚁肌细胞增强因子2与肌钙蛋白Ⅰ亚基基因的克隆及其在发育中的表达研究[D];陕西师范大学;2010年
5 韩瑞丽;鸡visfatin和PRDM16基因遗传变异及其效应与表达研究[D];西北农林科技大学;2010年
6 刘媛;三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)cDNA文库构建、EST分析及抗脂多糖因子研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2011年
7 赵欢;刺参Apostichopus japonicus (Selenka)对温度胁迫响应分子机理的基础研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2011年
8 姜珊;两种水产动物抗菌肽的重组表达工艺优化与药理药效研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2011年
9 李柯;粘虫取食行为候选基因的克隆与表达研究[D];陕西师范大学;2011年
10 孙晨;甲壳动物抗菌肽及信号转导和转录激活因子(STAT)的基因克隆与功能分析[D];山东大学;2011年
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1 魏礼玲;MYB转录因子家族相关EST干涉载体构建及遗传转化的研究[D];华中农业大学;2010年
2 杨堃;鹅CYP7A1基因克隆、表达调节及表达规律的研究[D];华中农业大学;2010年
3 郭慧芝;中华绒鳌蟹cDNA文库的构建及免疫相关基因的克隆与表达[D];华中农业大学;2010年
4 王国栋;利用微阵列技术筛选大白猪和二花脸猪经产母猪排卵卵泡差异表达基因[D];华中农业大学;2010年
5 冯玖玲;杜氏盐藻RbcS基因家族新成员的克隆及功能研究[D];郑州大学;2010年
6 杜斌;小麦芒长抑制基因B1近等基因系的鉴定及遗传分析[D];山东农业大学;2010年
7 高琳娜;黄金菊组织培养及植株再生体系的建立[D];辽宁师范大学;2010年
8 曹甲;柳蚕丝素重链基因的克隆和表达分析[D];安徽农业大学;2010年
9 刘倩;复合免疫增强剂对凡纳滨对虾生长、存活及非特异性免疫力的影响[D];中国海洋大学;2010年
10 崔江华;黄河口中华绒螯蟹养殖技术研究与应用[D];中国农业科学院;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 堵南山,赖伟,薛鲁征;中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)精子顶体反应的研究[J];动物学报;1987年01期
2 堵南山,薛鲁征,赖伟;中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)雄性生殖系统的组织学研究[J];动物学报;1988年04期
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4 马长艳,周开亚,郭豫杰,王义权,潘鸿春,赵乃刚,汪朝晖;中华绒螯蟹卵巢RACE cDNA文库的构建[J];动物学杂志;2003年02期
5 陈越,王莉,卫红飞,杨煜,于永利;双阳型梅花鹿脾脏细胞cDNA文库的构建和四个EST的发现[J];吉林大学学报(医学版);2004年03期
6 马丹丹;康现江;董丽君;穆淑梅;王琦;刘桂荣;;中华绒螯蟹精巢发育组织学[J];水产科学;2006年06期
7 李斌;李淑文;李长友;李国勋;;害虫生防新靶标——昆虫中肠围食膜的研究进展[J];东北农业大学学报;2007年01期
8 褚衍亮,姜乃澄,王玥;甲壳动物神经肽的结构和功能[J];东海海洋;2002年01期
9 马长艳,周开亚,郭豫杰,王义权,赵乃刚,汪朝晖;中华绒螯蟹卵巢差减cDNA文库的构建[J];动物学研究;2003年01期
10 杨频;张浩;陈立侨;叶金云;禹娜;顾志敏;宋大祥;;利用COI基因序列分析长江与澜沧江水系日本沼虾群体的遗传结构(英文)[J];动物学研究;2007年02期
中国博士学位论文全文数据库 前4条
1 武会娟;西农萨能奶山羊泌乳初期和盛期乳腺差异表达基因的筛选、克隆鉴定及功能研究[D];西北农林科技大学;2007年
2 邵明瑜;栉孔扇贝生殖相关基因DEAD-box家族和boule的cDNA克隆及其发育表达图式[D];中国海洋大学;2007年
3 郑明刚;皱纹盘鲍表达序列标签及免疫相关基因的克隆与表达研究[D];中国海洋大学;2007年
4 张丽娟;西农萨能奶山羊泌乳中期和后期乳腺差异表达基因的筛选及gBTN1A1基因功能的研究[D];西北农林科技大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
1 曲迪;中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)精荚破裂以及精子顶体酶活力研究[D];华东师范大学;2007年
2 孙宁;一个新的精子发生相关基因GON-SJTU1的克隆与表达[D];上海交通大学;2008年
3 屈旭光;联会复合体相关基因与犏牛雄性不育关系的研究[D];南京农业大学;2008年
【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前3条
1 张凤英;马凌波;蒋科技;张丹;陈立侨;;拟穴青蟹vasa基因cDNA的特征分析与性腺特异表达[J];海洋渔业;2010年04期
2 韩坤煌;张子平;王艺磊;邹志华;;Cyclin-CDK-CKI及UPP参与生殖调控及在甲壳动物性腺发育中的研究进展[J];生物技术通报;2010年07期
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中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 郭春雨;虾青素对中华绒螯蟹的影响及作用机理[D];河北大学;2007年
2 孙江玲;中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)精巢vasa基因克隆与表达分析[D];华东师范大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 宋霞,周开亚;甲壳类的眼柄神经激素[J];动物学杂志;2000年04期
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6 堵南山,陈炳良,赖伟;中华绒螯蟹幼体消化系统发育的研究[J];海洋与湖沼;1992年01期
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8 顾志敏,何林岗;中华绒螯蟹卵巢发育周期的组织学细胞学观察[J];海洋与湖沼;1997年02期
9 孙金生,刘安西,贺秉军,陈家童,相建海;不同甾醇类物质对河蟹眼柄神经分泌细胞I_(Ca)的影响[J];海洋与湖沼;2001年06期
10 邵红光,张亚平,柯欣,岳巧云,尹文英;南极隐线粒体COⅡ基因序列及无翅类昆虫分子进化[J];中国科学C辑:生命科学;2000年03期
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3 陈若篪,程遐年,杨联民,殷向东;褐飞虱卵巢发育及其与迁飞的关系[J];昆虫学报;1979年03期
4 姜晓舜,薛瑞德;库蚊卵巢滞育与激素调节的关系[J];中国媒介生物学及控制杂志;1991年01期
5 李少菁,林淑君,刘理东,王桂忠;锯缘青蟹卵巢发育过程中不同器官组织脂类和脂肪酸组成[J];厦门大学学报(自然科学版);1994年S1期
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7 刘文彬,张轩杰;黄颡鱼的卵巢发育和周年变化[J];湖南师范大学自然科学学报;2003年02期
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9 廖顺源;二化螟雌蛾生殖系统和卵巢发育观察[J];昆虫知识;1988年06期
10 张耀光,罗泉笙,何学福;长吻鮠的卵巢发育和周年变化及繁殖习性研究[J];动物学研究;1994年02期
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1 周娴颖;谢淑武;周洁芸;郭湘洁;桂幼伦;李钊;曹霖;朱焰;;母体接触双酚A对子代大鼠子宫和卵巢发育的影响[A];中国药理学会第七届全国生殖药理学术交流会论文摘要汇编[C];2011年
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3 孙金如;;粘虫蛾卵巢发育、交配情况与迁飞关系的初步分析[A];北京昆虫学会成立四十周年学术讨论会论文摘要汇编[C];1990年
4 李富花;于奎杰;李诗豪;谢玉素;相建海;;对虾性别控制和卵巢发育分子机制初探[A];中国甲壳动物学会第十一届年会暨学术研讨会论文摘要集[C];2011年
5 林琼武;吴超;刘晨晨;姚东明;李少菁;;日本囊对虾卵巢发育过程器官组织生化组分含量的变化[A];中国甲壳动物学会第十一届年会暨学术研讨会论文摘要集[C];2011年
6 温荣;李富花;谢玉素;相建海;;对虾细胞凋亡易感性蛋白(CAS)在对虾卵巢发育中的功能研究[A];中国甲壳动物学会第十一届年会暨学术研讨会论文摘要集[C];2011年
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8 丰浪;吴旭干;成永旭;;饲料中DHA/EPA比例对三疣梭子蟹卵巢发育、肝胰腺和卵巢生化组成以及脂肪酸含量的影响[A];中国甲壳动物学会第十一届年会暨学术研讨会论文摘要集[C];2011年
9 刘敏;熊邦喜;;细鳞鲴卵巢发育的组织学观察[A];中国鱼类学会2008学术研讨会论文摘要汇编[C];2008年
10 盛晓洒;刁晓明;李育培;权恒;翟旭亮;曹豫;;嘉陵江瓦氏黄颡鱼卵巢生物化学周年变化的研究[A];中国南方十六省(市、区)水产学会渔业学术论坛第二十六次学术交流大会论文集(上册)[C];2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
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2 副主任医师 季玉梅;我女儿为何阴道出血[N];医药养生保健报;2008年
3 罗忠良;少女贫血“功血”作怪[N];大众卫生报;2004年
4 记者 操秀英姜海;美发现数百个控制女性生育基因[N];科技日报;2007年
5 本报记者 冯卫东;性别大战:是“他”还是“她”?[N];科技日报;2010年
6 清风;白带异常与性生活有关[N];中国中医药报;2006年
7 ;猪的品种与杂交组合选择[N];湖北科技报;2005年
8 南阳市第一人民医院 杨锋;少女常见月经病的防治[N];上海中医药报;2005年
9 张天华;平胸少女吃什么[N];大众卫生报;2007年
10 王振坤;女性的阴道防线[N];家庭医生报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 马长艳;中华绒螯蟹卵巢发育相关基因的研究[D];南京师范大学;2003年
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3 徐永江;星鲽生殖生理和内分泌特征研究[D];中国海洋大学;2011年
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5 朱宁希;白血病多药耐药相关基因的研究[D];浙江大学;2001年
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7 曹月青;鉴定不同基因组之间差异序列的新方法研究[D];重庆大学;2005年
8 朱运峰;神经细胞中酒精调控基因的鉴定及其功能研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年
9 杜昌升;牙鲆抗病毒及免疫相关基因的克隆鉴定及表达分析[D];中国科学院研究生院(水生生物研究所);2005年
10 崔青曼;中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)卵巢发育调控技术研究[D];南京农业大学;2005年
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3 丰浪;高不饱和脂肪酸(HUFA)对三疣梭子蟹卵巢发育、内分泌激素以及组织生化组成的影响[D];上海海洋大学;2011年
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5 张艳;三疣梭子蟹卵巢发育期间卵黄蛋白原(Vg)、卵黄磷蛋白(Vn)及Vg-mRNA表达的变化研究[D];上海海洋大学;2011年
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9 杨小龙;长角血蜱卵巢发育与卵黄发生的研究[D];河北师范大学;2003年
10 刘永华;野蚕黑卵蜂卵巢发育和卵子发生的研究[D];山西农业大学;2004年
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