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《南京师范大学》 2005年
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人骨髓间质干细胞诱导突变致瘤的分子机制研究

韩崇旭  
【摘要】:在体外用GM-CSF和IL-4刺激人胚胎骨髓间质干细胞(MSCs)向树突状细胞(DCs)分化的过程中,我们发现了一种新的细胞,经克隆化培养和鉴定,具有肿瘤特性,命名为F6细胞株。本文旨在研究F6肿瘤细胞的发生机制。 我们应用下列方法(1)采用荧光差异显示(FDD)技术寻找MSCs诱导致瘤(F6)的关键基因。(2)采用实时定量PCR(RT-PCR)技术、Western blotting、PI染色流式细胞仪鉴定F6细胞和间质干细胞中相关基因的表达。(3)采用RT-PCR,Western blotting,免疫组化,荧光显微镜,共聚焦显微镜,研究nucleostemin基因在F6细胞和cos7细胞的特性。(4)利用RNAi、Western blotting、流式细胞仪技术,探讨nucleostemin对F6和U937细胞增殖的影响。(5)利用Real-time RT-PCR定量检测F6致裸鼠肿瘤瘤组织及人肺癌患者肿瘤组织的nuleostemin、cyclinⅠ和siva基因的表达特性。研究取得以下结果: (1)荧光差异显示成功地分离了胚胎MSCs和F6肿瘤细胞之间的不同基因片段,TA克隆得到15个EST片段,GeneBank序列比对分析表明,这些片断均与相关基因片断同源,其中C356,G392和G383分别与nucleostemin,cyclin Ⅰ和Siva基因同源(95%,97%,100%)。 (2)从LTEP-a-2细胞中克隆了nucleostemin的全长基因(1650bp,GenBank接受序号:AY825265),并且在大肠杆菌中表达GST-nucleostemin蛋白。观察了它在F6和其它4种人肿瘤细胞株(LTEP-a-2,U937,SW480 and 95D)中的表达特性。同时,用pcDNA3.1(+)-GFP-nucleostemin转染COS7细胞,在4-20周内,其细胞体积和核都增大,细胞呈巨细胞样改变,提示细胞分裂时nucleostemin影响细胞微管和微丝系统。Western blotting表明nucleostemin在F6,LTEP-a-2,U937,SW480 and 95D的细胞核和细胞浆中的表达水平比在MSCs和COS-7中明显增高(0.01-0.001,n=3)。同免疫组化染色的结果一致。 (3)SCID裸鼠实验表明在注射F6细胞4周后产生肿瘤。实时定量PCR结果
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