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《南京师范大学》 2006年
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毛冠鹿睾丸组织cDNA文库的构建及PRM1基因的研究

张文  
【摘要】:为构建毛冠鹿睾丸组织cDNA文库,用TRIzol试剂提取总RNA,利用SMART(switching mechanism at 5′ end of RNA transcript)技术合成cDNA第一链,双链cDNA经LD-PCR(Long-distance PCR)扩增并经sfi I酶切和过柱分级分离后,克隆入经sfi I酶切的λTrip1EX2载体,经体外包装而成cDNA原始文库。该毛冠鹿睾丸组织cDNA原始文库含有独立克隆数为5.52×10~5,重组率达90.8%。文库扩增后,滴度达1.05×10~9pfu/mL,插入cDNA平均长度为1.01kb。通过随机挑取噬菌斑,并克隆测序,从该文库中克隆了毛冠鹿睾丸组织表达基因:P1精蛋白基因(PRM1)(GenBank序列号:DQ299383),该cDNA具有5’和3’非编码区,从第95至250个核苷酸为一完整阅读框(ORF),此阅读框编码一个51Aa的P1精蛋白。结果显示本文构建的毛冠鹿睾丸组织cDNA文库符合建库要求,可作为进一步克隆毛冠鹿睾丸组织特异表达基因的可靠材料。 提取毛冠鹿基因组DNA,用EcoR I、EcoR V和Pst I酶切毛冠鹿基因组DNA。将酶切后的基因组DNA转移至尼龙膜。用PCR法标记PRM1基因地高辛(DIG)探针,进行Southern杂交。结果显示,经EcoR I酶切的基因组DNA和探针杂交后雌雄结果无差异。3种限制性内切酶消化并杂交后,都产生了2条带,而且限制酶切图谱表明该基因内部(包括内含子)无此3种内切酶位点。以上结果表明PRM1基因在毛冠鹿基因组DNA中存在两种形式的拷贝。 以毛冠鹿脑、肌肉、心脏、肺、睾丸、肾、肝和脾的总RNA为模板,合成cDNA第一链。用毛冠鹿P1精蛋白基因特异引物RT-PCR分析了不同组织PRM1表达状况。为保证模板用量的一致,以毛冠鹿β_2-微球蛋白基因的RT-PCR扩增产物作为阳性对照。结果表明PRM1基因仅在睾丸组织中表达,而其他组织不表达。 由于PRM1基因具有高度进化速率,使得它们成为一个很有效的系统进化分子标记。根据毛冠鹿PRM1 cDNA序列设计引物。从毛冠鹿、小麂、赤麂、黑麂和獐的基因组DNA中克隆PRM1基因。结果显示,5种动物的PRM1基因都只含有1个内含子,内含子序列长度都是101个碱基。用从GenBank中检索的牛PRM1基因为外群,用Clustalx1.8、Mega3.0及
【学位授予单位】:南京师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:Q78

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【参考文献】
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